胞内模式分子 NLRP6在结核分枝杆菌感染过程的作用与机制研究

摘要

结核病（Tuberculosis）是一类由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引发的慢性传染病。近年来结核病的发病趋势有上升趋势，根据WHO发布的全球结核病报告，2015年全球有1040万新发病例，接近140万死于结核病。
　　结核病是结核分枝杆菌通过呼吸道感染引发的传染病，其中肺部结核是主要的发病状态，另外还有淋巴结核，骨结核等。结核分枝杆菌是典型的胞内致病菌，巨噬细胞是结核分枝杆菌主要的宿主细胞。当机体感染结核分枝杆菌后，巨噬细胞是机体抵抗结核分枝杆菌感染的第一道防线。巨噬细胞作为重要的抗原提呈细胞可以将抗原提呈给 T细胞，引发适应性免疫应答，进而进一步激活巨噬细胞对结核分枝杆菌进行有效的杀伤作用。在控制结核分枝杆菌感染方面，肺泡巨噬细胞是主要的效应细胞，肺泡巨噬细胞对结核分枝杆菌可以进行有效的杀伤，然而它也是结核分枝杆菌的避难场所。当机体感染结核分枝杆菌后，绝大部分人是不发病的，呈现潜伏感染的状态，只有少部分人呈现活动性结核的状态。当机体呈现潜伏性感染的状态时，肉芽肿中存在有相当量的感染了结核分枝杆菌的巨噬细胞，从这方面说，肺泡巨噬细胞就像一把“双刃剑”，对结核分枝杆菌有杀伤作用，同时为结核分枝杆菌提供了避难所。因此，研究巨噬细胞在结核分枝杆菌感染过程的作用与机制是十分必要的。
　　固有免疫应答是获得性免疫应答的基础，亦是机体抵抗病原体的第一道防线。巨噬细胞内有多种多样的胞内模式识别受体（Pattern Recognition Receptor，PRR），如RIG-I,AIM2,NLRP3，HMGB1等，他们能够与各种各样的病原相关模式分子（pathogen associated molecular pattern，PAMPs）相互作用，从而引发一系列免疫应答对结核分枝杆菌起到杀伤作用。不同的模式识别受体在结核分枝杆菌感染过程中发挥了不同的作用。新的胞内模式识别受体在结核分枝杆菌感染过程中的作用与机制需要进一步发现。
　　核苷酸结合寡聚化结构域样受体（nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptors，NLRs）家族是近年来研究比较多的一个参与免疫应答的庞大的炎症蛋白家族，在细胞凋亡、炎症、肿瘤等方面具有重要作用。NLRs家族是一类存在于细胞质内的模式识别受体PRRs，可以识别结合某些病原体或其产物所共有的高度保守的病原相关分子模式PAMPs，通过激活核因子NF-κ B、I型干扰素和炎性信号来促进免疫反应。目前发现人的NLRs家族蛋白有23种，而小鼠有34种，NLRs家族主要由氨基端N端结构域、中间NACHT结构域（NOD结构域）、C端富含亮氨酸的重复序列（leucine-rich repeats，LRR）三部分组成。N端为效应结构域，介导蛋白质相互作用，参与免疫应答。根据N端结构域不同，目前NLRs家族分子分成四类：1）NLR家族含pyrin结构域蛋白（NLR family，pyrin domain containing，NLRP）；2）NOD1和NOD2，主要功能是识别细菌肽聚糖亚单位，并激活NF-κB信号通路发生免疫应答；3）II类反式激活因子（classⅡtrans-activator，CIITA），调节主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC） II类分子的表达；4）白细胞介素-1β转化酶蛋白激酶激活因子（IL-1β-converting enzyme（ICE）-protease-activating factor，IPAF）/神经元凋亡抑制蛋白（neuronal apoptosis inhibitor protein，NAIP）。核苷酸结合寡聚化结构域样受体含pyrin结构域蛋白6（NLR family, pyrin domain containing6,NLRP6）是NLRs家族中一个比较特殊的成员，目前对其有一定的研究，但其功能和作用机理尚未完全明确。
　　核苷酸结合寡聚化结构域样受体含pyrin结构域蛋白6（NLR family, pyrin domain containing6,NLRP6）是NLRs家族亚类NLRP中的一种，其编码基因位于人11号染色体，N端为热蛋白结构域（pyrin domain，PYD），中间为核苷酸偶联结构域（NACHT/NOD），C端为富含亮氨酸的重复序列（LRR），过去亦被命名为“含 PYRIN结构域的凋亡蛋白酶激活因子-1样蛋白5（PYRIN-containing Apoptosis protease activating factor（Apaf）-1-like proteins5，PYPAF5）。NLRP亚家族中的分子比如NLRP3可以被外源性或内源性危险信号通过激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-1，产生IL-1β、IL-18等细胞因子，从而发生炎性反应或细胞坏死，与其他NLRs家族蛋白不同，NLRP6是具有抑制天然免疫反应相关信号通路的NLR蛋白家族成员，其可以抑制NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路。NLRP6还可与Caspase-1和含CARD结构域的凋亡相关颗粒样蛋白（apoptosis associated speck-like protein containing CARD，ASC）通过N端PYD结构域的蛋白-蛋白连接作用组成细胞内多聚蛋白复合物，称为NLRP6炎症复合体，属于炎症小体（inflammosome）的一种，参与炎症免疫应答。NLRP6作为一类干扰素刺激基因ISGs在肠道表皮细胞中通过与DHX15、MAVS相互作用可以参与I型干扰素的产生，具有抗病毒的作用。巨噬细胞作为结核分枝杆菌的天然宿主细胞，NLRP6在结核分枝杆菌感染巨噬细胞的过程调控作用是未知的。因此本论文着重对NLRP6在结核分枝杆菌感染过程的作用与机制展开研究，并且我们发现NLRP6在结核分枝杆菌感染巨噬细胞过程中与胞内分子相互作用通过负调控作用抑制了炎症通路的激活，但并不参与炎性小体的形成。
　　第一部分、结核分枝杆菌对NLRP6表达的调节
　　在此部分研究中，首先我们用结核分枝杆菌毒株（H37Rv）感染骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）6小时后检测该细胞中炎症相关细胞因子的mRNA水平，结果显示H37Rv感染后各炎症因子都有明显上调，与文献报道相符，证明细胞感染模型的建立成功。用H37Rv感染BMDMs，检测NLRP亚家族中几个关键的胞内分子NLRP1b，NLRP2，NLRP3，NLRP6，NLRP10，NLRP12的表达。首先，我们发现在H37Rv感染巨噬细胞BMDMs在不同的时间点（0h,2h,4h,8h,12h,24h），感染8h的情况下，用实时定量PCR（qPCR）方法检测NLRP6呈现明显的下调表达；其次，不同的剂量（MOI=0.1,MOI=1,MOI=10）的H37Rv感染 BMDMs，发现NLRP6 mRNA表达在依赖剂量持续下调表达；最后，NLRP6 mRNA水平在不同的来源的巨噬细胞包括：骨髓来源的巨噬细胞（ BMDMs），腹腔巨噬细胞（Peritoneal macrophages，PMs），RAW264.7细胞系中呈现一致的下调表达。同时，我们分别在不同的时间点，不同的剂量的结核分枝杆菌在蛋白水平检测NLRP6的表达，由于NLRP6在巨噬细胞的本底表达水平并不是很高，我们先用NLRP6抗体与beads结合通过Immunoprecipitation（IP）手段对NLRP6进行富集，再通过western-blot法检测NLRP6的表达。
　　第二部分、NLRP6抑制结核分枝杆菌激活NF-κB以及MAPK信号通路
　　1.NLRP6基因的克隆及各真核表达载体的构建
　　为了研究NLRP6在结核分支杆菌感染巨噬细胞的作用，我们从日本京都大学的Kohsuke Tsuchiya教授课题组索取了N-Terminal FLAG-NLRP6,pcDNA6.2对照质粒，pcDNA6.2-shRNA-NLRP6质粒。送公司测序正确后，我们设计了相关的引物将目的片段插入到pMSCV-GFP，pMSCV-puro质粒，构建上调表达质粒pMSCV-GFP-NLRP6,pMSCV-puro-NLRP6。送公司测序正确后，将质粒进行转染，细胞转染后pMSCV-GFP-NLRP6经western blot和免疫荧光检测，pMSCV-puro-NLRP6经western blot检测都能够正常表达。
　　2.NLRP6基因上调表达病毒包装及相应细胞株的建立
　　为了研究NLRP6在结核分枝杆菌感染过程中的作用，我们通过pMSCV-GFP-NLRP6,与辅助质粒以一定比例共转染293T细胞，48h后收集含病毒的细胞上清，感染RAW264.7细胞通过分选构建NLRP6上调稳定表达的细胞株。pcDNA6.2-shRNA-NLRP6含有真核表达的筛选基因blasticdin，将此质粒转染RAW264.7细胞48小时后，经blasticdin药物进行筛选，并经过单克隆的挑取，构建稳定下调的稳转株。
　　3.NLRP6抑制H37Rv感染巨噬细胞后的炎症反应
　　在H37Rv感染NLRP6上调RAW264.7细胞后，我们用Real-time PCR的方法检测了细胞中TNF-α和IL-6等炎症因子的mRNA表达水平，其中在H37Rv感染NLRP6上调的稳转株中，TNF-α，IL-6等细胞因子有明显的下调，而IL-1β，IL-18并没有明显的变化，和之前文献报道一致。
　　4.NLRP6通过与EIF2S1相互作用抑制了NF-κ B以及MAPK信号通路的激活
　　NLRP6抑制了炎症因子的表达，我们检测了相关炎症信号通路的变化，发现NLRP6抑制了NF-κ B以及MAPK信号通路的激活。在上调的稳转株中，我们通过western-blot方法在0min，15min，30min，60min，120min，240min不同的时间点检测了p65,p-p65,ERK,p-ERK,IκBα等转录因子的表达，p-p65，p-ERK，IκBα有明显的下调趋势，表明NLRP6具有抑制NF-κB以及MAPK信号通路的作用。我们将pMSCV-flag-NLRP6及pMSCV的质粒转染293T细胞，之后TNF-α刺激12小时用Flag beads通过IP实验将NLRP6进行富集，将处理好的样品做银染实验，取差异性条带做质谱，发现差异性分子EIF2S1可能和NLRP6相互作用。构建Flag-NLRP6以及Myc-EIF2S1的质粒，通过western-blot手段检测质粒正常表达，将构建的好的质粒按照一定比例转染293T细胞之后TNF-α刺激12小时做IP实验，发现NLRP6可以与EIF2S1相互作用。同时我们用H37Rv感染上调的稳转株，发现EIF2S1没有明显的变化，但是p-EIF2S1在上调稳转株中有明显的下调表达。
　　5.NLRP6抑制了巨噬细胞M0→M1方向极化
　　为了探究NLRP6在巨噬细胞极化方面的作用，我们首先用LPS+IFN-γ共同刺激不同来源的巨噬细胞，通过Real-time的方法检测NLRP家族的主要分子，发现NLRP6呈现明显的下调表达，同时我们用Western-blot的方法进一步验证了NLRP6确实是呈现下调表达的。我们用H37Rv感染上调的稳转株，24小时检测M1型的细胞因子TNF-α，IL-6，iNOS，IL-12等细胞因子，发现NLRP6抑制了M1型的细胞因子的表达。我们用LPS+IFN-γ共同刺激上调稳转株,用Real-time手段检测M1型细胞因子发现NLRP6抑制了细胞因子的表达，同时ELISA方法检测的蛋白水平的细胞因子与mRNA水平是一致的，证明NLRP6具有抑制巨噬细胞向 M1型极化的作用。
　　第三部分、NLRP6在小鼠感染结核分枝杆菌模型中的作用
　　1.结核分枝杆菌感染模型的建立
　　为了研究NLRP6在结核分枝杆菌感染过程中的作用，根据文献我们建立了分枝杆菌感染的小鼠模型和细胞模型。C57BL/6J小鼠经鼻腔感染1×107CFU/只剂量的BCG，4周后取样检测。病理切片和菌落形成单位（CFU）实验结果证明，正常小鼠肺脏经过HE染色后可以看到肺泡壁很薄，没有炎症细胞浸润及出血等症状，而BCG感染后的小鼠肺脏可以明显看到肺泡壁变厚，肺间质有大量炎症细胞浸润，肺泡腔有出血症状，某些部位的肺脏发生实变。另外感染后的小鼠肺脏中能检出约105-106数量级的分枝杆菌，未感染小鼠的肺脏中则没有该菌检出。综上结果说明小鼠感染模型建立成功。
　　2.NLRP6抑制结核分支杆菌感染后的炎症反应
　　为了研究小鼠感染分枝杆菌后NLRP6在体内的功能，我们以PEI包裹质粒体内转染的方法在小鼠体内上调表达NLRP6，滴鼻感染BCG，4周后取小鼠肺脏做病理切片，HE染色后镜下观察。结果发现，在BCG感染后各组小鼠的肺脏都有病变及炎症浸润。结果提示我们，NLRP6上调组小鼠的肺脏炎性浸润最少，只有很小的实质性结节形成，而其对照组病变则较为严重。通过肺损伤评分我们能很直观的看出，NLRP6上调可以抑制小鼠肺部炎症的发生（p＜0.05）。
　　3.NLRP6在小鼠体内抑制结核分支杆菌的清除
　　结核分枝杆菌之所以不易被宿主清除，是因为结核分支杆菌能够逃逸免疫系统的杀伤，为了研究NLRP6在分枝杆菌感染小鼠模型中是否对该病菌的生存产生影响，我们做了细菌载量CFU实验，结果显示，NLRP6过表达组的小鼠CFU数明显高于对照组。同时我们对小鼠肺脏进行处理，进行流式检测，比较各组发现CD4+T，CD8+T数目并没有明显的变化，有趣的是IFN-γ在mRNA水平有明显的变化，NLRP6组IFN-γ的表达明显低于对照组，提示我们NLRP6抑制了IFN-γ在肺脏中的表达。根据文献报道，我们也对单核细胞及粒细胞进行了检测，发现NLRP6组小鼠的外周血粒细胞及单核细胞的数量明显少于对照组，NLRP6组小鼠的肺脏中的粒细胞及单核细胞的数量同样少于对照组。

目录

声明

引言

第一部分：结核分枝杆菌对NLRP6表达的调节

前言

材料和方法

结果

讨论

第二部分：NLRP6抑制了结核分枝杆菌引发的NF-κB以及MAPK 信号通路的激活

前言

材料和方法

结果

讨论

第三部分：NLRP6在小鼠结核分枝杆菌感染模型中的作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述:NLRP6:多方面的胞内免疫识别受体

摘要

前言

NLRs在固有免疫系统中

NLRP6在髓系细胞中的作用

NLRP6调控宿主与微生物的联系

NLRP6对病毒感染的调控

NLRP6蛋白与非酒精性脂肪性肝病

对NLRP6的调控

结语

参考文献

附录

个人简介

1. 基本情况：

2. 攻读学位期间所学课程和成绩：

2. 在读期间参加学术会议：

3. 在读期间所获奖励：

4. 攻读学位期间公开发表和待发表的专利及文章：

致谢