多模态力学刺激对兔纤维环源干细胞分化的调控研究

摘要

第一部分周期性拉伸应力刺激调控兔纤维环源干细胞相关代谢的研究
　　目的：纤维环退变乃至破裂是引发椎间盘退变的主要原因之一。一般认为，纤维环的退变主要由于过度力学负荷导致细胞外基质代谢发生失衡所引起。本研究在细胞水平拟通过对纤维环源干细胞（AFSCs）施加不同条件的拉伸应力刺激，考察拉伸应力刺激对细胞基质中合成与分解代谢相关基因表达的影响，考察不同条件的拉伸力学刺激对AFSCs合成与分解代谢的影响，为纤维环组织工程和纤维环组织退变机理的研究提供参考。方法：利用酶解法从新西兰大耳白兔的纤维环组织中提取和培养AFSCs，将AFSCs接种于弹性硅胶皿（PDMS）上，分别采用拉伸幅度为2％、5%、12%，拉伸频率为0.5赫兹，拉伸时间为4小时/天的条件进行分组实验，对照组为未给予拉伸应力刺激组。利用RT-qPCR、ELISA分析考察不同组别中合成代谢基因（Col-I， Col-II，Aggrecan）、分解代谢基因（MMP-3，MMP-13，TIMP-1）和相关蛋白的表达情况；利用F-actin和DAPI染色观察不同条件拉伸应力刺激下AFSCs的形态；应用细胞牵引力测试分析细胞受到不同条件拉伸应力刺激后细胞牵引力的变化。结果：与对照组相比，在2%和5%拉伸幅度的应力刺激组中，AFSCs的合成代谢基因（Col-I， Col-II，Aggrecan）表达有所上调，而5%拉伸应力刺激组中升高更明显，其分解代谢基因（MMP-3，MMP-13，TIMP-1）无显著变化；在12%拉伸幅度的应力刺激组中，其合成代谢基因（Col-I，Col-II，Aggrecan）表达均下降，而分解代谢基因（MMP-3， MMP-13，TIMP-1）表达均明显上调；相关蛋白的表达与基因的表达相一致。骨架染色和普通光镜结果显示细胞形态在对照组，2%，5%拉伸幅度的应力刺激组中未见明显的差异，而在12%拉伸幅度的应力刺激组中细胞骨架模糊。牵引力测试结果显示随着应力刺激拉伸幅度的增加，其细胞的牵引力是逐渐减少的。结论：周期性拉伸应力刺激能够调控兔AFSCs的合成与分解代谢基因的表达，且与应力刺激水平密切相关。合适条件的拉伸应力刺激能够促进细胞的合成代谢相关基因的表达，而过度的拉伸应力刺激能够促进细胞的分解代谢相关基因的表达。
　　第二部分不同弹性模量脱细胞纤维环基质与壳聚糖的交联弹性体对兔纤维环源干细胞分化的调控
　　目的：通过不同质量分数的京尼平交联脱细胞纤维环基质（DAFM）与壳聚糖制备不同弹性模量的富含生物因子的弹性体支架，并考察支架的力学特性（弹性模量）对AFSCs代表性基因的调控，为纤维环组织工程提供参考。方法：通过调节京尼平的质量分数制备不同弹性模量的富含生物因子的弹性体支架，并通过力学测试、原子力显微镜（AFM）、扫描电镜（SEM）、红外光谱（FTIR）和接触角等考察支架的弹性模量、化学成分、结构以及亲疏水性等物理性能。接种 AFSCs后，通过 CCK8、免疫荧光、RT-qPCR、ELISA、细胞牵引力等检测手段表征AFSCs在不同弹性模量的富含生物因子的弹性体支架上的增殖能力、细胞形态、细胞代表性基因（Col-I、Col-II、Aggrecan）表达、相关蛋白的表达和细胞牵引力大小等，以考察该系列弹性体的力学特性（弹性模量）对 AFSCs分化的影响。结果：通过调节京尼平的质量分数来交联DAFM和壳聚糖，可构建出含有生物因子的不同弹性模量支架，其杨氏模量分别为45 KPa,80 KPa,120 KPa。弹性体支架的颜色随着弹性模量的增加而逐渐加深，内部结构逐渐变密，SEM和AFM结果显示支架表面均可见胶原纤维分布，而接触角结果显示其亲水性能良好。AFSCs在三种不同弹性模量的支架中增殖情况均良好但细胞形态可见差异，而在未含有DAFM的支架上，其细胞增殖情况和细胞状态均较差。骨架染色和SEM结果显示在高弹性模量支架上的细胞呈类梭形，而在低弹性模量支架上的细胞呈类圆形。细胞牵引力随着支架弹性模量的增加而逐渐降低。Col-I的基因表达量会随着支架弹性模量的增高而逐渐增高，而Col-II和Aggrecan的表达量则随着弹性模量的增加而逐渐减少，其相关的蛋白表达量与其相应的基因表达量一致。结论：京尼平交联DAFM和壳聚糖能够构建出含有生物因子的具有不同弹性模量的支架，其能够模拟纤维环组织内、中、外三区的结构特点和力学性能，同时发现支架的力学特性（弹性模量）能够调控AFSCs向天然纤维环组织相似力学特性区域的细胞分化，本研究结果可为纤维环组织工程研究提供参考，同时也为支架的力学性能能够调控干细胞分化的理论提供参考。
　　第三部分多模态双重力学刺激对兔纤维环源干细胞分化的调控
　　目的：目前纤维环组织工程存在以下问题：细胞与材料之间的黏附作用较差，其分泌的细胞外基质较少导致构建的仿生纤维环组织的生物力学性能较差，不能达到天然纤维环组织的生物力学性能；所以，通过改善纤维环组织工程支架的生物活性，真正在结构和功能对纤维环组织进行模拟，同时通过外在的力学刺激促进细胞外基质的分泌达到纤维环在功能和结构上的仿生。因此，本项目通过构建模拟天然纤维环组织力学特性的支架加上外在的力学刺激，即多模态的力学环境调控AFSCs的分化和细胞外基质的分泌，为纤维环组织工程和纤维环组织退变机理的研究提供一定的参考。方法：首先，通过第二部分中的制备方法在PDMS培养皿中制备富含生物因子的不同弹性模量的弹性体支架，并通过普通光镜、AFM、SEM等考察支架的化学成分与结构等物理性能。不同弹性模量支架接种AFSCs后，通过第一部分中的拉伸力学刺激条件给予动态培养，之后给予骨架染色、RT-qPCR、ELISA等检测手段表征 AFSCs在不同弹性模量的富含生物因子的弹性体支架上，经过不同条件的拉伸力学刺激后的细胞形态、代表性基因（Col-I、Col-II、Aggrecan）的表达等，以考察支架的力学特性（弹性模量）和外在力学刺激双重因素对AFSCs分化的影响。结果：通过调节京尼平的质量分数来交联DAFM和壳聚糖，在PDMS培养皿中构建出不同弹性模量的支架；将 AFSCs接种于三种不同弹性模量的支架后给予2%，5%拉伸幅度的力学刺激后在高弹性模量支架上的细胞呈类梭形，而在低弹性模量支架上的细胞呈类圆形，12%拉伸幅度刺激组的细胞形态未见明显区别，但定向排列较其它组更明显。给予2%，0.5赫兹，4小时/天的力学刺激：在低弹性模量支架上，细胞经过力学刺激后其 Col-I的基因表达是下降的，而Col-II和Aggrecan基因表达量与对照组相比较未见明显差异，在中弹性模量支架上，细胞经过力学刺激后其Col-I的基因表达呈下降趋势，而Col-II和Aggrecan基因表达量与对照组相比较未见明显改变，在高弹性模量支架上，细胞经过力学刺激后其Col-I的基因表达稍升高，而Col-II和Aggrecan基因表达量与对照组相比较呈下降趋势；给予5%，0.5赫兹，4小时/天的力学刺激：在低弹性模量支架上，细胞经过力学刺激后其 Col-I的基因表达呈下降趋势，而 Col-II和Aggrecan基因表达量与对照组相比较呈上升趋势，在中弹性模量支架上，细胞经过力学刺激后其Col-I、Col-II和Aggrecan基因表达量与对照组相比较未见明显改变，在高弹性模量支架上，细胞经过力学刺激后其 Col-I的基因表达稍升高，而 Col-II和Aggrecan基因表达量与对照组相比较呈下降趋势；给予12%，0.5赫兹，4小时/天的力学刺激：在所有的弹性模量支架上，细胞经过力学刺激后其 Col-I、Col-II和Aggrecan基因表达量与对照组相比较都呈下降趋势。结论：京尼平交联DAFM和壳聚糖构建支架的力学特性（弹性模量）和外在的力学刺激能够对AFSCs的分化产生影响，即多模态力学刺激能够调控AFSCs的分化，本研究结果可为纤维环组织工程研究和纤维环退变机制提供参考。

目录

声明

引言

参考文献

第一部分 周期性拉伸应力刺激调控兔纤维环源干细胞相关代谢的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 不同弹性模量脱细胞纤维环基质与壳聚糖的交联弹性体对兔纤维环源干细胞分化的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 多模态双重力学刺激对兔纤维环源干细胞分化的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文总结

综述:纤维环组织工程：成就与展望

中英文缩略词对照表

攻读博士学位期间论文发表情况

参加国内、国际学术会议情况

主持与参与的科研项目

致谢