流感病毒低剂量重复感染免疫机制和H7N9禽流感疫苗研究

摘要

第一部分、流感病毒低剂量重复感染模型的构建及机制研究
　　流行性感冒是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染疾病。流感病毒主要通过飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播，具有传染性强、发病率高等特点，容易在人群中引起流行或暴发，对人类的公共健康构成严重危胁，每年在全球范围内造成约5000万人感染，其中约50万人死亡。由于流感病毒突变率和重组率较高，很容易出现耐药毒株，因此应对流感病毒流行最有效的手段为疫苗接种。在现有的疫苗研究中，通常采用单次大剂量流感病毒攻击感染来评估疫苗的免疫保护效果。然而在自然感染过程中，个体有可能在特定的时间和空间内反复多次低剂量接触流感病毒后获得感染。在这个过程中，机体抗病毒的免疫应答并不清楚。为了研究流感病毒低剂量重复感染过程中机体的免疫反应机制，并为流感研究提供更接近自然感染的动物模型，我们首次构建了流感病毒低剂量重复感染的小鼠动物模型，系统研究了流感病毒低剂量重复感染后小鼠的病理变化和免疫反应。
　　在本研究中，6-8周龄雌性C57BL/6小鼠分别通过鼻腔吸入感染不同剂量的A/PR8流感病毒和PBS，低剂量重复感染组每隔24h感染一次，共感染三次。通过对小鼠的体重变化、生存率、肺部病毒滴度和病理损伤的检测，发现流感病毒低剂量重复感染在动物体内引起的损伤比单次大剂量感染造成的损伤严重，表现为重复低剂量感染组小鼠体重丢失严重、生存率低、小鼠肺部病毒滴度高并且肺组织损伤严重。我们检测了流感病毒初次感染后第7天小鼠体内的病毒特异性抗体反应和CD8+T细胞反应，发现重复低剂量感染组小鼠体内的抗体产生较单次大剂量感染组小鼠弱，而病毒特异性CD8+T细胞的激活水平在各小组之间没有显著性差异。此外，我们进一步检测了流感病毒初次感染后第7天肺部炎症小体NLRP3相关细胞因子IL-1β和IL-18的产生情况，以探讨该动物感染模型的致病机理，发现流感病毒低剂量重复感染组动物体内的细胞因子IL-1β和IL-18的产生较高。所以我们推测重复低剂量感染组小鼠体内可能出现了“细胞因子风暴”反应，从而造成了小鼠体内损伤严重。进一步研究发现，传统灭活三价流感疫苗可以保护小鼠免受流感病毒单次大剂量的攻击感染，但是不能保护小鼠抵御流感病毒低剂量重复攻击感染，提示该动物模型在流感药物或疫苗效果评估中具有重要的应用价值。
　　通过本研究的开展，我们首次建立了流感病毒感染动物的新模型，并探讨了流感病毒重复感染过程中小鼠的病理变化和免疫反应。该动物模型为流感疫苗和药物研发提供了更真实、有效的评价平台，并为研究流感预防和治疗的新策略提供技术支撑。
　　第二部分、基于黑猩猩腺病毒载体的H7N9新型流感疫苗研究
　　2013年春天，上海、安徽等地相继出现新型H7N9禽流感感染疫情，给人们的生命健康、日常生活造成了巨大影响。H7N9流感疫情自2013年出现以来一直没有得到有效控制，虽然H7N9流感病毒还没有进化出人传人的能力，但是禽传人的事例时有发生。人类感染H7N9流感病毒后轻则表现出普通感冒的症状，重则导致呼吸衰竭甚至死亡。2016-2017年冬春之际，我国出现了第5次H7N9爆发高峰，这次疫情比之前更为严重，表现为发病时间早和发病率高，并且此次H7N9病毒出现了耐药性突变和毒力增加的现象。根据国家卫计委公布的2016年12月和2017年1月全国法定传染病疫情概况，两个月内全国感染H7N9发病数为298例，死亡为99例。目前各类H7N9疫苗的研发都在进行，灭活H7N9疫苗和弱毒活疫苗在动物模型中试验效果良好，有些已经处于临床一期研究。但是，这些传统疫苗在生产过程中需要生物安全3级实验室，使得生产成本较高，并且传统疫苗免疫原性较弱，需要免疫佐剂辅助；另一方面这些疫苗的稳定性不好，保存条件要求高，保存不当会引起疫苗失效。因此新型H7N9疫苗的研发显得极为重要。
　　病毒载体在疫苗研发和肿瘤治疗研究中被证明是一种非常有效的病毒载体，目前已有多个病毒载体药物被临床批准。在本研究中，我们用表达 H7N9血凝素蛋白（HA）的重组腺病毒AdC68-H7HA作为新型疫苗，检测了其免疫原性及保护效果，并对其免疫保护机制进行探索。即首先将HA基因从野生型H7N9流感病毒通过反转录方法扩增获得，然后将HA基因克隆至复制缺陷型腺病毒AdC68的E1区，得到重组腺病毒载体AdC68-H7HA。将重组腺病毒载体线性化后转染至HEK293细胞中进行包装拯救，进而对重组腺病毒AdC68-H7HA进行扩增纯化，检测目的蛋白H7N9血凝素HA的表达。此外，为了对比评价DNA疫苗的免疫效果，我们构建了H7N9 DNA疫苗pCAGGS-H7HA。因此，在本研究中，我们系统评价了DNA疫苗单独免疫、腺病毒疫苗单独免疫以及DNA疫苗初免腺病毒疫苗加强免疫的免疫策略。将AdC68-H7HA(5u1010vp)、pCAGGS-H7HA(50μg)、pCAGGS-H7HA(50μg)和AdC68-empty(5u1010vp)以肌肉注射的方式免疫四组小鼠，其中一组pCAGGS-H7HA(50μg)在两周后用AdC68-H7HA(5u1010vp)加强免疫，作为Prime-boost组。免疫后检测小鼠体内的抗体产生情况、H7特异性的CD8+T细胞的激活情况。然后通过攻毒实验来确定重组腺病毒疫苗以及DNA疫苗能否保护小鼠抵御致死H7N9剂量的攻击感染，并且通过血清被动转移试验和CD8+T细胞清除来探讨重组腺病毒疫苗的保护机制。为了进一步评价重组腺病毒疫苗的有效性，我们用重组腺病毒疫苗对豚鼠进行了免疫接种，发现可以在豚鼠体内诱导较高的体液免疫反应。总之，通过本项研究，我们发现重组腺病毒疫苗以及DNA疫苗初免腺病毒加强免疫能有效激活小鼠及豚鼠体内的特异性免疫反应，并可以保护小鼠不受致死剂量的H7N9流感病毒的攻击感染。

目录

声明

第一部分 流感病毒低剂量重复感染模型的构建及机制研究

第一章 序言

1.1 流感病毒简介

1.2 流感疫情的防控策略

1.3 现有流感疫苗评价模型及其局限性

第二章 正文

2.1 实验材料与方法

2.2 实验结果

2.3 讨论与展望

第二部分 基于黑猩猩腺病毒载体的H7N9新型流感疫苗研究

第一章 引言

1.1 H7N9流感病毒病原特性及其流行现状

1.2 H7N9流感疫苗的研究策略

1.3腺病毒载体简介

1.4本研究的目的

第二章 正文

2.1 实验材料和方法

2.2 实验结果

2.3 讨论与展望

第三部分综述 禽流感疫苗的研究现状

一、传统疫苗

1.1 全病毒灭活疫苗

1.2弱毒禽流感疫苗

二、新型禽流感疫苗

2.1 亚单位疫苗

2.2 DNA疫苗

2.3 重组病毒载体疫苗

2.4基于RNA干扰技术的禽流感疫苗

2.5病毒样颗粒疫苗

三、展望

参考文献

附录

基金资助

博士期间发表的文章及成果

致谢