IL-33通过调节CD4+Th9细胞的效应功能和IL-9的表达介导肿瘤免疫应答的初步研究

摘要

肿瘤微环境(tumor microenvironment)是肿瘤细胞赖以生存的复杂环境，除了肿瘤细胞本身，还存在有间质细胞、浸润的免疫细胞以及分泌的一系列分子。肿瘤微环境中肿瘤浸润免疫细胞的数量、类型和功能及其与肿瘤细胞间的相互作用决定了机体肿瘤免疫应答的格局和肿瘤的进展与预后。其中，CD4+辅助性T细胞（Thelper cell，Th）及CD8+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocytes，CTLs）介导的细胞免疫应答是机体抗肿瘤免疫的重要物质基础。
　　肿瘤微环境产生的多种免疫抑制因子会导致CD4+Th1细胞及CD8+CTLs细胞处于耗竭状态，使机体难以产生有效的抗肿瘤免疫应答。因此,寻找一种可以激活肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)功能，并且改变肿瘤微环境免疫抑制状态的新分子和新方法,已成为肿瘤免疫治疗的研究热点。
　　白细胞介素（interleukin，IL）33是于2005年发现的白细胞介素1家族的第11个成员（IL-1F11），与其受体ST2及IL-1受体辅助蛋白（IL-1RAPC）组成的受体复合物结合，主要介导Th2型免疫应答。此外，尚有研究发现，IL-33也能够介导Th1细胞的分化和干扰素γ（interferon，IFN）的产生，从而具有潜在抗肿瘤免疫应答功能，但是IL-33的抗肿瘤免疫应答作用机制尚不明了。
　　人的IL-9基因位于5号染色体5q31-q35，和鼠的IL-9基因具有55％的氨基酸同源性。IL-9与其受体IL-9R结合，可诱导蛋白酪氨酸激酶（Janus kinase，JAK）1和JAK3磷酸化，激活STAT1、STAT3、STAT5形成二聚体复合物，在细胞核内启动一系列基因的表达、转录，从而发挥生物学作用。IL-9是CD4+Th9细胞亚群分泌的一个重要细胞因子，通过分泌IL-9，CD4+Th9细胞可参与多种免疫应答。许多研究发现，相比于Th1和Th17细胞，抗原特异性的CD4+Th9细胞在过继性细胞免疫治疗中通过CCL20/CCR6信号通路发挥更有效的抗肿瘤效应。此外，有研究发现，肝癌患者血清中IL-9表达明显高于健康个体，且IL-9的表达水平和预后有关。目前肿瘤免疫应答中，CD4+Th9细胞、IL-9的功能和机制及IL-9的表达调控尚未完全探明。
　　本课题组前期研究发现，IL-33在黑色素瘤（B16）荷瘤小鼠模型中可协同IL-12诱导CD8+T细胞表达IFN-γ，增强CTLs抗肿瘤的效应功能，减缓肿瘤的生长；在体外培养条件下，细胞因子IL-36β可以刺激小鼠CD8+T细胞分泌大量的IL-9。鉴此，本课题首先探讨在 Th9极化培养条件下，IL-33分别对人外周血单个核细胞（PBMCs）和鼠的脾脏细胞中纯化的CD4+T细胞活化、分化和效应的影响，以期为将IL-33作为CD4+Th9细胞抗肿瘤免疫应答的调节因子运用于过继性细胞免疫治疗提供理论依据和新的策略。继而借助IL-9基因敲除小鼠，进一步探讨IL-9在小鼠荷瘤模型中不同肿瘤进展时期的表达以及IL-9对肿瘤生长的影响，以研究IL-33是否通过抑制IL-9在肿瘤微环境的表达而介导抗肿瘤免疫应答以及可能的调控机制，以期为肿瘤免疫治疗提供新的方法和思路。
　　第一部分、IL-33调节体外培养的人CD4+Th9细胞的效应功能目的：研究重组人/鼠IL-33（rhIL-33/mIL-33）是否能够在Th9极化培养条件下直接作于人/鼠CD4+T细胞，增强体外培养的人/鼠CD4+Th9细胞活化、分化和效应功能，并促进其细胞因子的分泌，为IL-33在CD4+Th9细胞过继性细胞免疫治疗的临床转化运用研究提供理论依据。
　　方法：1）采集健康人外周血单个核细胞（PBMCs），用CD4免疫磁珠阳性分选富集纯化CD4+T细胞，体外分别经CD3 mAb(100ng/ml)+CD28 mAb(200ng/ml)+IL-4(10ng/ml)+TGF-β(1ng/ml)(Th9 condition)，CD3 mAb(100ng/ml)+CD28 mAb(200ng/ml)+IL-4(10ng/ml)+TGF-β(1ng/ml)+IL-33(30ng/ml)两种不同细胞因子组合刺激培养，96h后收集细胞；每组再经CD3 mAb(100ng/ml)或者CD3 mAb(100ng/ml)+IL-33(30ng/ml)两种不同细胞因子再刺激培养4h、24h，收集细胞及上清。2）制备小鼠脾脏单细胞悬液，用CD4免疫磁珠阳性分选富集纯化CD4+T细胞，体外分别经CD3 mAb(5μg/ml)+CD28 mAb(2.5μg/ml)+IL-4(10ng/ml)+TGF-β(1ng/ml)(Th9 condition)，CD3 mAb(5μg/ml)+CD28 mAb(2.5μg/ml)+IL-4(10ng/ml)+TGF-β(1ng/ml)+IL-33(50ng/ml)两种不同细胞因子组合刺激培养，96h后收集细胞；每组再经CD3 mAb(5μg/ml)、CD3 mAb(5μg/ml)+IL-33(50ng/ml)两种不同细胞因子再刺激培养4h、24h，收集细胞及上清。经Real-time PCR检测各组细胞IL-9、IFN-γ、颗粒酶A（granzyme A）、IL-17A、PU.1、IRF4、CCL20、CCR6等分子mRNA水平的表达；经免疫荧光抗体标记，流式细胞术分析各组细胞IL-9、IFN-γ的表达。
　　结果：
　　1. IL-33显著上调人CD4+Th9细胞IL-9、IFN-γ、Granzyme A、IL-17A以及转录因子PU.1、IRF4和趋化因子CCL20及趋化因子受体CCR6的表达；
　　2. IL-33显著上调小鼠CD4+Th9细胞IL-9、IFN-γ和Granzyme A的表达。
　　结论：在体外培养条件下，IL-33能够增强CD4+Th9细胞的效应功能，促进细胞抗肿瘤免疫应答，可以为肿瘤过继免疫治疗提供新的思路和方法，具有潜在的临床运用价值。
　　第二部分、IL-33通过调节IL-9在肿瘤微环境的表达介导抗肿瘤免疫应答目的：探讨IL-33是否通过调节IL-9在肿瘤微环境的表达介导抗肿瘤免疫应答。
　　方法：建立C57BL/6 WT小鼠和IL-9基因敲除（KO）小鼠B16及B16-IL-33黑色素瘤模型，每组5只，观察肿瘤生长，绘制小鼠肿瘤生长曲线；在肿瘤生长的早、中、晚期，分别取每组小鼠肿瘤，采用Real-time PCR检测不同时期肿瘤组织IL-9 mRNA水平的表达。
　　结果：
　　1.在小鼠B16荷瘤模型中，C57BL/6 WT小鼠肿瘤生长速度快于IL-9KO小鼠，而在B16-IL-33荷瘤模型中，C57BL/6 WT小鼠和IL-9KO小鼠肿瘤生长则差异不大；
　　2.随着肿瘤进展，B16肿瘤微环境中持续高表达 IL-9；B16-IL-33肿瘤微环境低表达IL-9。
　　结论：在B16荷瘤小鼠肿瘤组织中，IL-9的表达随着肿瘤的发展而持续上调，微环境表达的IL-33则在肿瘤组织内抑制IL-9的表达，从而发挥抗肿瘤免疫应答，其确切的调节机制仍有待进一步深入探讨。

目录

声明

研究背景

1. 白细胞介素33简介

2. 辅助性T细胞（T helper cell，Th）9和IL-9

参考文献

第一部分 IL-33调节体外培养的CD4+Th9细胞的效应功能

前言

1. 材料与试剂

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

参考文献

第二部分 IL-33通过调节IL-9在肿瘤微环境的表达介导抗肿瘤免疫应答

前言

1. 材料与试剂

2. 方法

3. 统计学分析

4. 结果

5. 讨论

参考文献

全文小结与展望

小结

展望

综述: IL-9的生物学特性和功能

研究生期间发表论文

本课题所受基金资助

缩略词表

致谢