去泛素化酶对细胞抗EV71病毒感染天然免疫反应的分子调控机制研究

摘要

肠道病毒71型（enterovirus71, EV71）属于小RNA病毒科，人类肠道病毒科A组病毒，它可以引起手足口病（hand, foot, and mouth disease, HFMD）以及严重的中枢神经系统病变，如脑炎、无菌性脑膜炎、急性驰缓性麻痹、神经源性肺水肿等全球性传染病，而且EV71主要感染5岁以下的儿童。自2008年手足口病在我国流行以来，EV71已被纳入我国病毒管理条例中作为第三类监管病毒，然而，目前临床上还没有针对EV71病毒感染的特异性疫苗或治疗药物可用，因此，增强机体自身的天然免疫防御对于抵抗EV71感染具有重要的实际意义。
　　天然免疫是机体抵御病原微生物感染的第一道防线，在病原微生物入侵的情况下，宿主细胞通过自身的模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）来识别病原体的相对保守成分，这些成分被称为病原相关分子模式（ patho ge n-assoc iated molecular patterns, PAMPs），从而激活机体下游的天然免疫反应，诱导I型干扰素（type Iinterferon, IFN-I）以及多种促炎细胞因子的产生，以抵御病原微生物的感染。对于病毒感染而言，宿主细胞可以通过多种细胞内的模式识别受体来识别病毒的入侵，从而激起宿主细胞的抗病毒天然免疫反应，这些受体包括To ll样受体（ TLR-）3，7/8，9以及RIG-I样受体（RLRs）。
　　泛素化修饰是蛋白质的翻译后修饰形式之一，这一过程控制着蛋白质的命运以及功能。与蛋白质的磷酸化修饰相似，蛋白的泛素化修饰也是可逆的，即去泛素化酶（deubiquitinating enzymes, DUBs）移除蛋白质分子上修饰的泛素分子以逆转这一修饰，从而调控细胞信号转导、DN A损伤修复、免疫功能的发挥等多种生物学进程。近年来的研究揭示，宿主细胞抗病毒天然免疫反应的激活不但需要宿主细胞对病原体的识别，也依赖于信号通路中相关信号分子的泛素化修饰，其中肿瘤坏死因子相关因子3（TNF-associated factor3, TRAF3）的以第63位赖氨酸（K63）连接的多聚泛素化修饰对于干扰素调控因子3（IFN regulatory factor3, IRF3）的磷酸化以及IFN-I的产生是必需的。近来研究已经发现多种泛素连接酶（E3 ligase）可以调控宿主细胞的抗病毒天然免疫反应。同样地，去泛素化酶也可以通过调控信号分子的泛素化修饰进而调控宿主细胞的抗病毒天然免疫反应，然而，去泛素化酶是否可以通过调控宿主细胞的抗病毒天然免疫进而影响EV71的感染及其调控机制还有待研究。
　　为了探究是否去泛素化酶对EV71诱导的IFN-I天然免疫反应的具有调控作用，我们首先利用PCR芯片技术筛选EV71感染的横纹肌肉瘤细胞（RD）中差异表达的去泛素化酶分子，通过分析验证，我们发现泛素特异性蛋白酶19（USP19）在EV71病毒感染过程中表达上调，而且这种变化与病毒所诱导的IRF3的磷酸化水平负性相关。在进一步的研究中，我们发现，下调内源性 USP19的表达显著增强 EV71以及Poly(I:C)所诱导的细胞中IFN-I天然免疫信号的活化。为了深入研究USP19对细胞中IFN-I天然免疫反应的分子调控机制，我们通过免疫共沉淀技术联合质谱分析的方法发现，USP19可以和细胞中 IFN-I天然免疫信号通路中重要的接头分子——TRAF3相互作用。在接下来的研究中，我们发现USP19通过其分子N-端结构域以及C-端结构域与TRAF3相互作用；而且，USP19抑制TRAF3分子的K63-多聚素化修饰，其对TRAF3的去泛素化修饰依赖于分子C-端的C19去泛素化酶活性结构域，但并不依赖于其分子 N端的结构域。利用 siRNA下调 USP19基因的表达则能够显著增强TRAF3分子的K63泛素化修饰，这对细胞中IFN-I抗病毒天然免疫反应的活化是非常重要的，也因此显著抑制了EV71病毒的增殖。
　　综上所述，我们发现USP19通过去泛素化修饰TRAF3而抑制细胞中IFN-I天然免疫信号反应，从而维持EV71病毒在宿主细胞中的增殖，这也是从宿主去泛素化酶角度来解析EV71病毒逃逸宿主免疫防御的又一证据。

目录

声明

第一章 研究背景

第一节泛素-蛋白酶体系统

第二节 抗病毒天然免疫的信号转导及泛素化调控

一、天然免疫的模式识别

二、模式识别受体介导的信号转导及泛素化调控

三、IFN-I介导的抗病毒效应

第三节EV71感染及免疫逃逸

第二章 实验材料和方法

第一节 实验材料

一、细胞系及细胞培养

二、病毒株及病毒扩增

三、抗体

四、表达载体

五、主要试剂及试剂盒

六、特殊仪器设备

第二节 实验方法

一、主要试剂的配制

二、主要实验方法

第三章 实验结果

第一节 参与调控细胞抗EV71感染的IF N-I天然免疫反应中关键去泛素化酶分子的筛选及功能研究

1. USP19在EV71感染过程中表达上调

2. USP19负性调控细胞内IFN-I抗病毒天然免疫反应

3. USP19靶向TRAF3并通过其蛋白分子的N-端以及C-端结构域与TRAF3分子相互作用

4. USP19通过其分子C-端的C19去泛素化酶结构域对TRAF3进行去泛素化修饰

第二节 去泛素化酶US P19参与细胞中的抗EV71感染天然免疫反应

第四章 讨论与总结

一、USP19通过去泛素化修饰TRAF3而抑制细胞的IFN-I抗病毒天然免疫反应

二、USP19参与EV71病毒感染的免疫逃逸

第五章 结 论

参考文献

综述

主要缩略词表

攻读硕士学位期间主要的学术成果

致谢