斑马鱼kisspeptin生殖功能及其受生物钟和雌激素调控机制研究

摘要

Kisspeptin是由KISS1基因编码的前体蛋白水解得到的一系列小肽，是GnRH分泌最强有效的促进剂。在哺乳动物中，Kiss1的定时激增决定了GnRH的定时激增:Kiss1神经元表达大量雌激素受体，介导了排卵前的雌激素正反馈和非排卵期的雌激素负反馈作用;Kiss1基因表达呈脉冲式，在雌激素条件下，脉冲表达的均值呈现昼夜节律;脉冲式的Kiss1使得GnRH神经元同步化。依赖于Kisspeptin神经元对雌激素信号和生物钟信号的整合作用，使GnRH的分泌高峰呈现雌激素依赖性的日节律模式。然而，Kisspeptin系统和功能在不同物种间差异很大。在斑马鱼等大多数脊椎动物中kisspeptin有两个拷贝。斑马鱼Kisspeptin的功能目前还不明确。斑马鱼中kisspeptin是否还受到生物钟的调控，是否响应雌激素信号？斑马鱼的kisspeptin有什么样的功能？斑马鱼两个Kiss1同源基因的表达模式和在生殖中的具体功能还未有阐明。因而，本论文旨在探索1．斑马鱼kisspeptin基因在斑马鱼生殖中的具体作用;2．生物钟是否直接调控kisspeptin基因的表达及如何调控？3．kisspeptin基因如何响应雌激素的刺激？4．生物钟蛋白是否与雌激素受体协同调控kisspeptin基因表达？5．以斑马鱼bmallb-/-为模型，探索生物钟紊乱如何对kisspeptin基因表达产生影响，从而影响生殖。
　　构建了热激诱导过表达kiss1和kiss2转基因鱼。通过多肽注射和热激诱导kiss1和kiss2过表达后的产卵实验，研究揭示了斑马鱼kisspeptin通路对生殖可能的作用机制。从而发现，Kiss1是一种gnrh3/lhb的激活因子，Kiss2是一种gnrh3/lhb的抑制因子。
　　利用RT-qPCR发现斑马鱼两个kisspeptin基因的mRNA水平都存在明显的振荡，但模式不同，kiss1和kiss2的表达峰值分别在ZT4和ZT3。用生物信息学软件对比分析了人，小鼠和斑马鱼的启动子区域，发现不同基因间调控元件有一定差异。双荧光素报告酶实验与ChIP实验从体外和活体两个水平揭示生物钟对两个kisspeptin基因调节的不同方式:生物钟通过钟控元件E-box调节kiss1基因;通过钟控元件D-box和RRE元件调节kiss2基因;在活体内不同生物钟蛋白对相应的功能性钟控元件的结合呈现日节律，但时相各不相同。Bmallb对kiss1启动子E-box结合峰值在ZT20;Tefa和Rorαa对kiss2的D-box和RRE的结合峰值分别在ZT8和ZT16。构建了kiss1和kiss2启动子驱动的虫荧光素酶基因转基因鱼，观察到了kiss1与kiss2基因在生物钟bmal b-/-突变体的表达改变，kiss1和kiss2的振幅都降低，kiss2振幅的降低更显著，同时kiss2的表达峰值在ZT0，相位后移约4h。
　　雌激素处理实验发现雌激素可能是通过Esr2a对kisspeptin起作用。双荧光素报告酶实验表明雌激素受体在雌激素存在条件下激活kiss1基因表达，并通过与生物钟蛋白Crylaa的直接结合，一起调控kiss1基因表达;雌激素受体可以在雌激素存在下激活kiss2基因表达，虽不与调控kiss2基因的生物钟蛋白直接结合，但它们的激活有加成。还发现了不依赖于雌激素的雌激素受体相关受体对kiss2基因表达激活作用，可能涉及代谢通路对kiss2的调控。
　　综上所述，研究发现生物钟可以直接调控斑马鱼kiss1与kiss2基因的表达，在雌激素存在的情况下，生物钟蛋白可以与雌激素受体共同作用调节kisspeptin基因的表达。生物钟的紊乱导致bmallb-/-中kisspeptin基因的表达的变化，影响了gnrh3/lhb的表达，产卵量降低。研究为以斑马鱼为模型研究生物钟蛋白与雌激素受体协同作用导致Kiss1定时激增的具体机制提供了基础。同时，研究结果扩充了比较生物学的知识:D-box调节kisspeptin基因是小鼠和斑马鱼共有的机制;E-box调节kisspeptin基因是人和斑马鱼共有的机制，小鼠不具有。人或小鼠Kiss1基因启动子没有钟控元件RRE，生物钟通过该元件对kiss2基因调控，是斑马鱼独有的一种调节机制。此外，构建的kiss1和kiss2启动子驱动的荧光素酶基因转基因鱼，以及热激诱导过表达kiss1和kiss2转基因鱼，为后续生物钟对kisspeptin基因调控机制，对kisspeptin基因功能，及生物钟紊乱对kisspeptin基因功能所造成影响的深入研究提供了有力的工具。

目录

声明

摘要

第一章 前言及研究意义

1．1 生物钟概述

1．1．1 生物节律

1．1．3 生物钟分子机制

1．1．4 生物钟功能

1．1．5 生物钟与生殖的密切关系

1．2 生殖与kisspeptin

1．2．1 生殖的雌激素依赖性日节律

1．2．2 生物钟与雌激素信号的整合机制-Kisspeptin通路

1．2．3 哺乳动物Kisspeptin及其作用机制

1．2．4 Kisspeptin基因的调控

1．2．5 Kisspeptin基因在不同物种中的多样性

1．3 斑马鱼的生物钟及生殖系统简述

1．3．1 模式动物斑马鱼概述

1．3．2 斑马鱼生物钟基因

1．3．3 斑马鱼脑及生殖系统

1．3．4 斑马鱼的kisspeptin基因

1．4 基因技术在斑马鱼的应用

1．4．1 基因打靶技术

1．4．2 Gateway技术

1．5 立题意义和主要研究内容

第二章 斑马鱼kisspeptin基因在生殖中的功能

2．1 多肽活体注射实验

2．1．1 实验目的

2．1．2 Kisspeptin多肽注射

2．1．3 产卵实验

2．1．4 生殖轴基因表达定量

2．1．5 实验结果

2．2 斑马鱼kisspeptin基因诱导性过表达转基因鱼构建

2．2．1 实验目的

2．2．2 载体的构建

2．2．3 显微注射及转基因鱼筛选

2．2．4 转基因鱼的热激活性验证

2．2．5 斑马鱼热激过表达kisspeptin基因转基因鱼生殖能力评价

2．2．6 实验结果

2．3 斑马鱼kisspeptin基因神经元杀伤转基因鱼系的构建

2．3．1 实验目的

2．3．2 载体的构建

2．3．3 显微注射及转基因鱼系筛选

2．3．4 实验结果

2．4 小结

第三章 生物钟和雌激素信号对斑马鱼kisspeptin基因的表达调控

3．1 体外水平生物钟对kisspeptin基因的表达调控

3．1．1 实验目的

3．1．2 斑马鱼胚胎和雌性成脑kisspeptin基因表达分析

3．1．3 kisspeptin基因的启动子分析

3．1．4 斑马鱼胁印甲砌基因启动报告虫荧光素酶基因载体及转基因鱼系的构建

3．1．5 双荧光素酶报告基因实验

3．1．6 实验结果

3．2 活体水平上生物钟对kisspeptin基因的表达调控研究

3．2．1 实验目的

3．2．2 Capped mRNA合成

3．2．3 显微注射

3．2．4 ChIP和PCR

3．2．5 qPCR

3．2．6 实验结果

3．3 体外水平雌激素信号对kisspeptin基因的表达调控

3．3．1 实验目的

3．3．2 斑马鱼雌激素受体基因克隆

3．3．3 双荧光素酶报告基因实验

3．3．4 实验结果

3．4 雌激素对活体kisspeptin基因表达的影响

3．4．1 实验目的

3．4．2 雌激素处理

3．4．3 RT qPCR

3．4．4．实验结果

3．5 生物钟与雌激素受体的协同作用生物钟核心蛋白与雌激素受体结合

3．5．1 实验目的

3．5．2 细胞转染

3．5．3 CoIP

3．5．4 Western blot

3．5．5 实验结果

3．6 小结

第四章 生物钟突变对斑马鱼kiss系统的影响

4．1 斑马鱼kisspeptin启动子驱动的不稳定荧光素酶转基因系的构建

4．1．1 实验目的

4．1．2 载体的构建

4．1．3 显微注射及转基因鱼系筛选

4．1．4 DD(Dark／Dark)条件化学发光扫描

4．1．5 实验结果

4．2 bmallb-／-突变体kisspeptin神经元的发育

4．2．1 实验目的

4．3 bmallb-／-突变体转录组测序

4．3．1 实验目的

4．3．2 实验方法

4．3．5 基因功能注释

4．3．6 富集生物学通路分析

4．4．7 RNA-Seq结果验证

4．4 小结

第五章 讨论、总结与展望

5．2 斑马鱼kissl和kiss2功能

5．3 生物钟对kisspeptin基因调控影响生殖

5．4 生物钟与雌激素信号整合对kisspeptin基因调控进而调节生殖

5．5 生物钟可能通过调节kisspeptin基因与其它信号整合调控生殖

5．6 展望及后期工作

6．1 实验材料

6．2 实验仪器及来源

6．3 实验试剂及来源

6．4 试剂的配制

6．4．1 核酸琼脂糖凝胶电泳溶液

6．4．2 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液

6．4．4 其他溶液

6．5 引物设计及合成

6．6 实验方法

6．6．1 载体构建相关实验

6．6．2 转座酶mRNA合成

6．6．3 显微注射

6．6．4 斑马鱼总RNA的提取

6．6．5 反转录制备cDNA模板

6．6．6 ChIP

6．6．7 qPCR

6．6．8 斑马鱼高质量基因组DNA提取

第七章 博士期间参与的其它工作

7．1 斑马鱼cry基因进化及功能分化研究

7．2 斑马鱼1号染色体敲除计划

参考文献

攻读学位期间发表的论文及专利

参与项目

缩略词

致谢