山茱萸环烯醚萜总苷及有效成分对糖尿病肾病的作用及作用机理分析

摘要

第一部分环烯醚萜总苷对糖尿病肾病大鼠的作用及作用机理分析 一、环烯醚萜总苷对糖尿病肾病大鼠体重、饮水量、进食量及血糖的影响 二、环烯醚萜总苷对糖尿病肾病大鼠肾脏等组织的保护作用 三、环烯醚萜总苷延缓糖尿病肾病大鼠的作用机理分析 (一)对血清糖基化终产物-肽(AGE-P)水平的影响 目的 探讨环烯醚萜总苷对糖尿病肾病大鼠血清糖基化终产物-肽(AGE-P)水平的影响。方法在正常进食条件下，大鼠先以30mg.kg<'-1> ip.STZ溶液，第二天再按0.11ml/只ip.FCA，每周1次，连续3周。3周后测定大鼠血糖，若血糖1≥6.7mM者则纳入为糖尿病大鼠，并按血糖值范围随机分为模型组、氨基胍组(O.1g.kg<'-1>)和环烯醚萜总苷组(0.25、0.5g.kg<'-1>)，同期另设一正常组，各组连续ig.12周。实验结束后，运用流动注射分析法(flow injection assay，FIA)检测不同组别血清中的AGE-P含量。结果模型组血清AGE-P 水平显著增加(14.3±4.3 vs 2.8±0.4，P＜0.01)，而环烯醚萜总苷及氨基胍均能降低血清AGE-P水平，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)。结论环烯醚萜总苷能降低糖尿病肾病大鼠血清 AGE-P 水平，具有抑制蛋白非酶糖基化作用。 (二)对肾脏和坐骨神经Na<'+>，K<'+>-ATP 酶活性的影响 目的 观察环烯醚萜总苷对糖尿病肾病大鼠肾脏和坐骨神经Na<'+>，K<'+>-ATP 酶活性的作用。方法在正常进食条件下，大鼠先以30mg.kg<'-l> ip.STZ 溶液，第二天再按0.11ml/只ip.FCA，每周1次，连续3周。3周后测定大鼠血糖，若血糖≥16.7mM者则纳入为糖尿病大鼠，并按血糖值范围随机分为模型组、氨山茱萸环烯醚萜总苷及有效成分对糖尿病肾病的作用及作用机理分析基胍组(0.1g.kg<'-1>)和环烯醚萜总苷组(0.25、0.5g.kg<'-1>)，同期另设一正常组，各组连续ig.12周。实验结束后采用ATP酶试剂盒及考马斯亮兰蛋白试剂盒测定糖尿病大鼠肾组织细胞膜和坐骨神经Na<'+>，K<'+>-ATP酶活性的改变。结果模型组Na<'+>,K<'+>-ATP酶活性明显降低(0.894±0.03vs0.964±0.02，P<0.01，肾；0.889±0.03vs 0.960±0.02，P<0.01，坐骨神经)，而环烯醚萜总苷Ⅱ组能显著改善Na<'+>，k<'+>-ATP酶活性(0.928±0.2 vs0.894±0.03，P<0.05，肾；0.931±0.02 w 0.889±0.03，P<0.05，坐骨神经)，具有良好的修复作用。结论从环烯醚萜总苷可修复糖尿病大鼠肾组织Na<'+>，K<'+>-ATP酶活性，我们推断其可能通过多元醇通路防治糖尿病肾病。 (三)对血清超氧化物歧化酶SOD水平的影响 目的 通过对大鼠血清SOD水平的变化，从氧化应激角度探讨环烯醚萜总苷对糖尿病肾病的作用。方法 在正常进食条件下，每只大鼠先以30mg／kg ip．STZ溶液，第二天再按0.11ml／只ip．FCA，每周1次，连续3周。3周后测定大鼠血糖，若血糖≥16.7mM者则纳入为糖尿病大鼠，并按血糖值范围随机分为模型组、氨基胍组(0.1g.kg<'-1>)和环烯醚萜总苷组(0.25、0.5g.kg<'-1>)，同期另设一正常组，各组连续ig.12周。实验结束后用黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD含量。结果造模12周后，糖尿病肾病模型大鼠血清SOD值较正常组显著降低(38.0±3.8vs49.5±4.1，P<0.01)，而环烯醚萜总苷Ⅰ、Ⅱ均能显著增加SOD的含量，与模型组比较有显著性差异(43.0±4.3 vs38.0±3.8，P<0.05；47.2±3.7 vs38.0±3.8，P<0.01)。结论环烯醚萜总苷可能通过抑制机体氧化应激反应来防治糖尿病肾病。 第二部分环烯醚萜总苷及有效成分对高糖及AGEs致肾小球系膜细胞损伤的保护作用及作用机理分析 一、高糖和AGEs对大鼠肾小球系膜细胞(RMC)增殖的影响 二、环烯醚萜总苷及有效成分对高糖和AGEs致RMC增殖的抑制作用 三、 环烯醚萜总苷及有效成分对高糖和 AGEs 致 RMC 增殖抑制作用的机理分析 (一)对高糖和AGEs 致 RMC Na<'+>，K<'+>-ATP酶活性的影响 目的 研究环烯醚萜总苷及有效成分对高糖和AGEs致RMC Na<'+>，K<'+>-ATP 酶活性的影响。方法用含高糖、AGEs 的 5％FBSRPMI-1640培养液配制莫诺苷、马钱子苷、环烯醚萜总苷、氨基胍和黄芪注射液，使葡萄糖终浓度为30mM，AGEs终浓度为0.25mg/ml，药物终浓度为1×10<'-4>M(1×10<'-2> g.L<'-1>)。同时设5％FBSRPMI-1640培养液、含30mM葡萄糖的5％FBSRPMI-1640培养液和含O.25mg/mlAGEs 的 5％FBSRPMI-1640培养液作对照。将0.25％胰酶消化、吹打均匀的RMC接种至96孔培养板内，在37℃、5％CO<,2> 饱和湿度培养箱内培养。待细胞贴壁后，血清饥饿24h，使细胞同步，后各组加药，培养48h后，将培养细胞消化、离心、弃上清，留下层细胞，用生理盐水制备成10<'7>/mm<'3>的悬液，再用超声粉碎器进行破碎。制备好的细胞悬液不需要离心，在测试加样前要摇匀后取样。然后按照试剂盒的要求先测试细胞蛋白含量，再进行Na<'+>，K<'+>-ATP 酶测定。结果高糖和AGEs显著降低Na<'+>，K<'+>-ATP 酶活性(0.059±0.021vs0.126±0.046，P＜0.05，高糖)；(0.057±0.020 vs0.126±0.046，P＜0.05,AGEs)，而莫诺苷、马钱子苷和环烯醚萜总苷均能提高其活性，与高糖和AGEs组相比差异显著。结论环烯醚萜总苷及有效成能充分修复高糖和AGEs对RMCNa<'+>，K<'+>-ATP 酶的损伤。 (二)对AGEs致RMC氧化应激的影响 目的 研究环烯醚萜总苷及有效成分对AGEs致 RMC 氧化应激的影响。方法 用含AGEs的5％FBSRPMI-1640培养液配制莫诺苷、马钱子苷、环烯醚萜总苷、氨基胍和黄芪注射液，使AGEs终浓度为0.25mg/ml，药物终浓度为1×10<'-4>M (1×10<'-2>gL<'-1>)。同时设5％FBSRPMI-1640 培养液和含0.25mg／mlAGEs 山茱萸环烯醚萜总苷及有效成分对糖尿病肾病的作用及作用机理分析的5％FBSRPMI-1640培养液作对照。在37℃、5％CO<,2>饱和湿度培养箱内培养48h后，取细胞上清液测定SOD、MDA和GSH-PX。将DCFH-DA配制成20μmol／L浓度的工作液，将各组RMC用0.25％胰酶消化，吹打成单个细胞悬液，调细胞数为1×106个，再用PBS洗涤2次，最后一次洗涤弃去PBS液，加入200μl工作液在37℃下孵育30min，再用PBS洗涤2次，吹打均匀，用400目尼龙膜过滤为单个细胞，上机检测。应用流式细胞仪分别检测各组的荧光强度，以荧光强度反映细胞内ROS含量。流式细胞仪参数：激发波长485nm，发射波长530nm。结果0.25mg／mlAGEs上调ROS、MDA(1293.28±72.69 vs287.15±17.18,P<0.001 ROS，4.46±0.95vs2.97±0.48，P<0.01 MDA)，下调SOD、GSH-PX(14.78±1.69 vs30.84±3.18，P<0.001 SOD，62.75±13.47 VS 93.87±14.27，P<0.01GSH-PX)，而莫诺苷、马钱子苷和环烯醚萜总苷能提高SOD、GSH-PX活力，降低ROS、MDA含量，与0.25mg／mlAGEs组比较有显著性差异(P<0.05)。结论环烯醚萜总苷及有效成分可能是通过抑制氧化应激来保护肾小球系膜细胞免受AGEs的损害，从而达到防治糖尿病肾病的目的。

目录

个人简历

前言

摘要

第一部分 环烯醚萜总苷对糖尿病肾病大鼠的作用及作用机理分析

第二部分环烯醚萜总苷及有效成分对高糖及AGEs致肾小球系膜细胞损伤的保护作用及作用机理分析

一、高糖和AGEs对大鼠肾小球系膜细胞(RMC)增殖的影响

二、环烯醚萜总苷及有效成分对高糖和AGEs致RMC增殖的抑制作用

三、环烯醚萜总苷及有效成分对高糖和AGEs致RMC增殖抑制作用的机理分析

参考文献

结语

综述 氧化应激与糖尿病肾病相关性研究进展

致谢