生肌玉红胶原促血管新生的实验研究

摘要

第一部分:研究背景：
　　 中医外科古代又名疡科，下肢慢性溃疡是中医外科治疗的优势病种之一，中医在此病的治疗中积累了丰富的临床经验。对于Ⅲ～Ⅳ期慢性下肢溃疡临床多运用生肌玉红膏为代表的药物外用，使得疮面肉芽新鲜，疮面减小。既往我们对生肌玉红膏治疗慢性溃疡进行了临床研究，证明生肌玉红膏可以促进慢性下肢溃疡创面微循环、加速创面肉芽生长及上皮生长，从而促进慢性下肢溃疡创面愈合。
　　 许多研究都在通过调整生肌玉红膏的药物组成来提高疗效。因此，如何通过进一步改良而提高疗效，是中医外科研究的热点之一。本研究拟用生肌玉红膏原方去除轻粉，以减轻其毒性，检测其对血管新生与发生的影响。
　　 高水平、快速的血管化一直是慢性创面修复研究的一个基本课题。应用胶原作为支架载入生长因子制造促血管生长的生物材料植入机体促血管生长为目前国际研究开发的前沿与热点之一。将修饰后的胶原作为减味生肌玉红膏敷料载体，发挥两者促创面愈合优势，是否可以进一步提高生肌玉红膏通过促进血管生成来提高生肌疗效，是本项目研究的重点。
　　 第二部:分制剂研究：
　　 目的：
　　 制备完成生肌玉红胶原制剂。
　　 方法：
　　 1．分别以醇提、油提、水提法提取生肌玉红膏药物组分，进行方法对比研究。
　　 2．牛跟腱组织以酶解法提取Ⅰ型胶原。
　　 3．对I型胶原进行肝素修饰，并通过EDC/NHS行交联。
　　 4．修饰交联后胶原真空冷冻干燥、环氧乙烷消毒，真空包装。
　　 5．根据实验需要将生肌玉红膏在无菌环境下载入胶原。
　　 6．对胶原制剂进行电镜扫描，考察其表面及内部结构。
　　 结果：与结论：
　　 以醇提加血竭素的方法获得的减味生肌玉红膏药物组分，经预试验证实药物组分及含量符合实验要求。酶解法可有效提取Ⅰ型胶原，得率可达30％以上。真空冷冻及交联后的胶原经扫描电镜扫描显示，胶原结构更加紧密有序，呈现相互连接、平行排列的高度多孔状结构，孔径在100～200μm之间。减味生肌玉红膏载入修饰后的胶原药物呈颗粒状散布在胶原裂隙与空隙中，大小约10μm～50μm左右，胶原基本结构未发生明显变化。
　　 第三部分:生物学评价
　　 目的：
　　 体外细胞学试验考察减味生肌玉红膏提取液和生肌玉红胶原促细胞增殖的作用和可能的细胞毒性作用，筛选减味生肌玉红膏提取液促细胞增殖的最佳浓度。体内试验考察生肌玉红膏载入胶原的组织相容性与降解性。
　　 方法：
　　 1．采用体外培养HUVEC的方法，通过MTT法观察减味生肌玉红膏提取液对血管内皮细胞增殖作用的影响：分为空白组，减味生肌玉红膏提取液1～8组，浓度分别为50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml、2.4mg/ml、3.2mg/ml不同浓度组，共9组。通过CCK-8法观察生肌玉红胶原制剂对血管内皮细胞增殖作用的影响：分为对照组及实验组1（胶原组）、实验组2（减味生肌玉红膏提取液1.6mg/ml）、实验组3（减味生肌玉红膏提取液1.6mg/ml+胶原）共4组。2．将生肌玉红胶原（实验组）与交联修饰后胶原（对照组）对称植入8只新西兰白兔背部皮下，分别于术后1、2、4及8周取出2组植入材料，行肉眼观察、埋植材料近旁组织切片后H-E染色显微镜下观察及对两组材料的扫描电镜(SEM)观察。
　　 结果：与结论：
　　 1.MTT法检测细胞增殖，可见50ug/ml～2.4mg/ml的生肌玉红膏提取液各个浓度的药物均可以促进细胞增殖，且以1.6mg/ml浓度组细胞增殖最强，达到28.19%，但是增加浓度达到2.4mg/ml时细胞增殖率骤降，达3.2mg/ml时，对细胞增殖起抑制作用。CKK-8法检测发现生肌玉红膏提取液及生肌玉红膏载入修饰后胶原制剂，与对照组比较均可明显促进HUVEC的增殖，以二者结合的制剂增生率最高。
　　 2．实验组（生肌玉红胶原）在植入兔背部局部炎症反应消失较对照组（修饰后胶原）明显提前，组织相容性较同期对照组良好，可促进近旁组织毛细血管新生与胶原新生。生肌玉红膏载入胶原较I型胶原自身组织相容性更佳，基本上发挥出生肌玉红膏及修饰后胶原各自促创面愈合的优势，与周围组织有更加良好的生物相容性。
　　 第四部分:鸡胚绒毛尿囊膜实验
　　 目的：
　　 探查生肌玉红胶原促鸡胚尿囊膜血管新生的效果，进一步筛选减味生肌玉红膏载入修饰后胶原的最佳剂量。
　　 方法：
　　 实验分控制组、对照组（单纯胶原）、实验组1（减味生肌玉红膏浓度0.8mg/ml载入胶原）、实验组2（减味生肌玉红膏浓度1.6mg/ml载入胶原）、实验组3（减味生肌玉红膏浓度3.2mg/ml载入胶原），各组植入7日龄鸡胚尿囊膜孵化7d后取出胶原制剂，考察鸡胚大体状况，测定植入制剂周围鸡胚尿囊膜内微血管数、尿囊膜内血红蛋白含量。
　　 结果：与结论：
　　 各实验组鸡胚尿囊膜内血管围绕胶原呈轮辐状生长，鸡胚尿囊膜包裹标本率实验组高于空白组，实验组胶原周围鸡胚尿囊膜微血管数、胶原内血红蛋白含量均高于对照组，差异有显著性意义(P＜0.01)；其中仍然以实验组2(1.6mg/ml)促血管新生作用最强，尿囊膜内血红蛋白量最多(P＜0.01)。提示减味生肌玉红膏提取液以1.6mg/ml的浓度载入胶原后可以促进鸡胚尿囊膜内血管新生的作用最强，应以此浓度的制剂进行后续实验。
　　 第五部分:兔背部皮下埋植实验
　　 目的：
　　 考察生肌玉红胶原在非缺血组织中促进血管新生从而促进创伤修复的作用效果与机制。
　　 方法：
　　 兔背部对称埋植胶原制剂，分别于术后3d，7d、14d、28d、56d取埋植的胶原制剂标本及标本周围约0.5cm范围的组织。考察埋植后动物的行为反应及局部情况，组织病理切片观察埋植物周围组织炎性反应及胶原增殖情况，通过光度计法测定胶原内血红蛋白含量以及免疫荧光与CD34染色标记法考察周围组织微血管新生情况，WesternBot法各时间点检测VEGF、ANG-1因子的表达，通过免疫组化法考察周围组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的生长情况及Ⅰ、Ⅲ型胶原的比例。
　　 结果：与结论：
　　 埋植后动物无特殊反应，病理切片观察显示胶原周围组织随着时间推移，炎性渗出减少，肉芽组织增生，到28d时已形成成熟的纤维结缔组织。胶原内血红蛋白检测、周围组织免疫荧光与CD34血管标记检测显示生肌玉红胶原可显著促进血管新生并诱导血管长入埋植后的胶原，其作用与对照组比较有统计学差异。WesternBlot法检测VEGF、ANG-1因子实验组各时间点表达均高于对照组，VEGF在术后第3d即达到峰值，而ANG-1在术后第7d达到峰值，显示出VEGF/ANG-11对血管新生不同的调节作用。而实验组生肌玉红胶原对Ⅰ型胶原的分泌与代谢影响不明显，与对照组比较无明显差异，对Ⅲ型胶原的调节作用主要出现在肉芽生长的后期阶段，可促进Ⅲ型胶原的分泌，从而降低Ⅰ、Ⅲ型胶原的比例，使得愈合更接近于正常组织愈合而对照组接近于疤痕愈合。表明在非缺血组织中，生肌玉红胶原可显著促进周围组织微血管新生，其机制之一是在不同时间点提高了VEGF/ANG-1的表达，二者的协同作用促进了血管的新生。生肌玉红胶原能调节胶原形成并调节Ⅰ、Ⅲ型胶原的比例而发挥促进组织愈合并减少疤痕愈合的作用。
　　 第六部分:大鼠后肢缺血组织埋植实验
　　 目的：
　　 探查生肌玉红胶原在缺血组织中促进血管新生的作用效果与作用机制。
　　 方法：
　　 制作大鼠后肢缺血模型，并于后肢缺血组织中埋植胶原制剂，分别于术后3d，7d、14d、28d取埋植的胶原制剂标本及标本周围约0.5cm范围的组织。通过激光散斑成像系统观察大鼠后肢创伤组织在各时间点的血流灌注情况，通过埋植胶原内的血红蛋白含量、周围组织各时间点的CD34微血管免疫组化标记计数观察检测生肌玉红胶原在缺血组织中对微血管新生的作用。实时荧光定量RT-PCR测定检测缺血组织各时间点HIF-1α-mRNA、VEGF-mRNA基因的表达，考察缺血组织中制剂促血管新生的作用机理。
　　 结果：与结论：
　　 激光散斑成像血流灌注检测显示术后当时大鼠后肢创伤组织呈现出明显的缺血状态，而术后3d却显示出明显的充血状态，术后7d、14d呈现出低于术前的血流灌注显示出缺血状态，至术后28d逐步回升。生肌玉红胶原仍然表现出强于胶原自身促微血管新生的作用，其作用机理是能够促进组织中HIF-1α-mRNA、VEGF-mRNA基因的高表达，其表达强度明显高于单纯埋植胶原组，且表达作用时间较长。

目录

声明

英文缩略词表:

第一章 研究背景与中医文献综述

1．慢性创面的研究现状与问题

2．中医药有关慢性溃疡创面的治疗及前期研究基础

第二章 制剂研究

第一节 生肌玉红胶原药物组分的提取及工艺优化

1.生肌玉红膏原方方药解析

2.减味生肌玉红膏药物组分的优化提取

第二节 胶原支架的修饰过程

1．I型胶原支架研究进展

2．I型胶原的提取

3．胶原的交联

4．胶原的真空冷冻干燥

5．修饰后胶原的环氧乙烷(EO)消毒灭菌

6．减味生肌玉红膏载入修饰后胶原

第三章 生物学评价及制剂优化筛选

第一节 基于人脐静脉内皮细胞增殖的生肌玉红原液浓度筛选研究

引言

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

第二节 生肌玉红胶原的组织相容性实验

引言

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

第四章 鸡胚尿囊膜实验筛选生肌玉红胶原促微血管新生的量效关系研究

引言

1.材料和方法

1.1 材料:

1.2 方法:

1.3 统计学分析:

2．结果

2.1 大体标本情况 见表4-1，图4-1。

2.2 胶原周围鸡胚尿囊膜微血管计数

2.3 尿囊膜血红蛋白含量

3．讨论

第五章 生肌玉红胶原促进兔背部肉芽组织血管新生与胶原合成的疗效与机制研究

引言

1．材料和方法

1.1 材料：

1.2 动物实验

1.3 观察指标及方法

1.4 统计学分析

2．结果

2.1 一般情况观察结果

2.2 组织学观察

2.3 植入胶原内血红蛋白检测

2.4 免疫荧光

2.5 CD34标记胶原周围组织微血管计数观察

2.6 VEGF、ANG1蛋白质印迹检测（Western Blot）

2.7 I、III型胶原免疫组化标记不同时间点平均光密度值

3．讨论

第六章 生肌玉红胶原促进大鼠后肢缺血组织血管新生的疗效与机制研究

引言

1．材料和方法

1.1 材料：

1.2 动物实验

1.3 观察指标及方法

1.4 统计学分析

2．结果

2.1 一般情况观察

2.2 激光散斑成像血流灌注检测

2.3 血红蛋白检测

2.4 CD34标记微血管计数观察

2.5 缺血肌肉组织HIF-1α-mRNA、VEGF-mRNA的表达

3．讨论

小结

参考文献：

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

作者简介