当归—川芎药对功效物质与配伍作用机理研究

摘要

在中医临床遣药组方过程中，常常两味中药一起配伍使用，有些源自经方，有些出乎时方，配伍之后具有良好的协调作用或较好的制约作用，这种两药味长期固定搭配出现即形成“药对”。近年来，药对的研究已逐渐深入，其研究重点已逐步从配伍“是否有效”向“为什么有效”以及“如何更有效”过渡。药对作为中药学和方剂学的重要桥梁，其研究对发展中医药配伍理论和创制现代中药都具有十分重要的理论意义与实践价值。因此，本论文以当归-川芎药对为实践对象，结合现代分析技术和前沿药学评价手段对其进行多角度、深层次的研究，基于系统生物学创新思维的整体研究与开发，对其功效物质基础及配伍作用机理进行系统评价。本论文得到国家自然科学基金——“芎归系列方功效变化的物质基础与相关机理研究”等项目资助。
　　本论文共分三章，各章节的主要内容及研究结果如下:
　　一、文献研究
　　本部分在对药对相关文献进行整理的基础上，系统综述了药对的功效物质基础、配伍效应、及现代研究策略与方法。首先，基于药对配伍煎煮过程发生的量变与质变、药对作用于机体或/和机体相关环境后的变化等方面分析并总结了近年来药对功效物质基础研究的最新进展;其次，从整体动物、组织、器官，与细胞分子等不同层面总结药对的配伍效应，以方剂-药对-单味药-成分（群）配伍-单体成分为主线，比较评价其协同增效或配伍减毒作用相关机制;然后，基于现代科学技术，总结归纳并提出药对的现代研究策略与方法;最后，在此基础上理出本论文的研究思路，设计合理可行的实验方案和技术路线。
　　二、归芎药对补血活血整合效应及其与效应成分的关联性分析
　　（一）基于UHPLC-TQ/MS法比较评价归芎药对中主要芳香酸类和苯酞内酯类成分的含量变化
　　建立超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法(UHPLC-TQ/MS)同时测定归芎药对及其组成药味中3个芳香酸（绿原酸、咖啡酸、阿魏酸）和6个苯酞内酯（洋川芎内酯I，洋川芎内酯H，洋川芎内酯A，丁基苯酞，藁本内酯、正丁烯基苯酞）成分的含量。采用ACQUITYTM UPLC BEH C18色谱柱，以0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)为流动相，梯度洗脱，流速0.4 mL·min-1，柱温30℃; Waters XevoTM TQ质谱仪以多反应离子监测（MRM）方式进行离子监测。各成分在10 min分离良好，在相应浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，相关系数均＞0.9948，加样回收率（n=6）为97.56％～102.24％，RSD范围为2.07％～4.67％。川芎单味药中各成分的含量高于当归单味药;归芎药对中各成分的含量并不等于两药味中各成分的加和，说明当归和川芎在共同煎煮过程中存在成分的相互作用。该方法简便、快速、重复性好、专属性强，适用于伞形科植物含有以上9种成分的快速含量分析。
　　（二）比较评价当归川芎配对伍用对血虚小鼠的补血作用
　　采用乙酰苯肼和环磷酰胺联合复制血虚小鼠模型。与正常组比较，血虚小鼠外周血常规中白细胞、红细胞、血红蛋白和红细胞压积均有显著性差异，说明模型成功复制。给予当归、川芎和归芎药对不同配比(1∶0、2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2、0∶1)、不同提取方法（水提模拟水煎、醇提模拟酒制、先水提后醇提模拟散剂应用）所得样品后，经过数据的标准化，分别从相同配比不同提取方法和同一提取方法不同配比来比较归芎药对的养血补血作用。结果发现，相同配比下，归芎药对水提液和先水提后醇提液对血虚小鼠的补血作用优于醇提液;相同提取方法下，归芎药对1.5∶1配比对血虚小鼠的补血作用较优。
　　（三）比较评价当归川芎配伍对急性血瘀大鼠血液流变学及凝血功能的影响
　　采用多指标综合指数法，对归芎药对1∶1和1.5∶1配比及其组成药味当归、川芎的水提物、醇提物和先水提后醇提物对急性血瘀大鼠的活血化瘀效应包括血液流变学和凝血功能活性进行评价。结果发现，当归、川芎单味药及归芎药对1∶1和1.5∶1的水提物、醇提物和先水提后醇提物给药均能降低血液流变学各指标，对凝血功能指标有显著改善作用。提取方法相同时，归芎药对1∶1醇提物给药组的总活血效应为最好，且川芎单味药的总活血效应优于当归;配比相同的情况下，醇提给药组的总活血效应优于水提和先水提后醇提给药组。说明当归-川芎配伍能明显改善血瘀大鼠的血液流变学及凝血功能异常。
　　（四）基于人工神经网络的归芎药对整体功效与化学物质关联性分析
　　采用人工神经网络技术，将归芎药对中的7个主要效应成分（阿魏酸、绿原酸、咖啡酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯、和正丁烯基苯酞）及3个芳香酸和4个苯酞内酯的总含量与养血补血、活血化瘀和调经止痛的整合效应进行了拟合性相关分析。结果发现，芳香酸，尤其是绿原酸和咖啡酸对养血补血效应贡献较大;芳香酸和苯酞内酯，尤其是绿原酸、洋川芎内酯I和H对活血化瘀贡献较大;芳香酸和苯酞内酯，尤其是藁本内酯、咖啡酸、阿魏酸和洋川芎内酯I对调经止痛效应贡献较大。芳香酸更偏重于补血活血，苯酞内酯更偏重于活血止痛。初步阐释方药不同功效的效应物质及其对整体功效的贡献大小，为方药复杂效应物质基础研究提供了新的思路与方法。
　　三、基于代谢及其组学和网络药理学的归芎药对补血活血作用机理研究
　　（一）当归、川芎和归芎药对中主要芳香酸类成分在血虚大鼠体内的代谢研究
　　采用UHPLC-QTOF/MS联用技术，通过能量梯度(MSE)和质量亏损过滤(MDF)方法，对灌胃给药归芎药对及其组成药味提取物后血虚大鼠血浆、尿液和胆汁中阿魏酸、绿原酸和咖啡酸3种效应成分的代谢转化特征进行分析。共鉴定得到阿魏酸代谢产物13个，血浆中4个，尿液中9个，胆汁中8个;主要为还原、水解、甲基化、去甲基后羟基化、乙酰化、甘氨酸结合、硫酸酯化、牛磺酸结合、1分子葡萄糖醛酸结合、2分子葡萄糖醛酸结合、硫酸结合+1分子葡萄糖醛酸结合、谷胱甘肽结合和S-谷胱甘肽结合代谢产物。绿原酸代谢产物6个，血浆中3个，尿液中5个，胆汁中5个;主要为甲基化、酯键水解、羟基化、甲基化后结合半胱氨酸、酯键水解后乙酰化和酯键水解后葡萄糖醛酸化代谢产物。咖啡酸代谢产物6个，血浆中4个，尿液中5个，胆汁中3个;主要为甲基化、乙酰化、硫酸酯化、甲基化+硫酸酯化、1分子葡萄糖醛酸结合、和甲基化+1分子葡萄糖醛酸结合代谢产物。结果说明，归芎药对及其组成药味提取物中芳香酸类成分在血虚大鼠体内存在多种Ⅰ相和Ⅱ相代谢产物，为阐明该药对及其组成药味在体内发挥疗效的功效物质基础提供依据。
　　（二）基于代谢组学的归芎药对及其组成药味对血虚大鼠的养血补血作用机制研究
　　基于多学科融汇交叉，采用计算机辅助分析方法，将药效学和代谢组学进行关联研究。首先，将灌胃给药归芎药对及其组成药味后对血虚大鼠的养血补血药效学进行评价，检测指标主要包括体重、外周血常规及脏器指数（脾脏和胸腺）。然后，采用代谢组学策略对血虚大鼠的血浆及尿液内源性生物标志物进行分析。在血浆和尿液中分别初步鉴定得到10个和5个潜在的生物标志物，主要为溶血磷脂酰胆碱类、鞘胺醇、油酸、8，11，14-二十碳三烯酸、神经酰胺、烟酸、焦磷酸硫胺素、植物鞘胺醇、羟孕烯醇酮和甘油磷酸胆碱。由于鞘氨醇和神经酰胺在血浆和尿液中均存在，故在血浆和尿液中共鉴定到13个潜在生物标志物。与正常组比较，血虚组大鼠的溶血性磷脂酰胆碱类、鞘胺醇、烟酸、焦磷酸硫胺素、植物鞘胺醇和甘油磷酸胆碱上调;而油酸、8，11，14-二十碳三烯酸、神经酰胺和羟孕烯醇酮下调。13个生物标志物主要参与的代谢通路有12条，其中以硫胺代谢和鞘脂代谢通路最为主要。将血虚的特征效应指标外周血常规与内源性生物标志物进行相关性分析发现，白细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞压积、单核细胞和中性粒细胞主要与鞘胺醇、植物鞘氨醇、溶血性磷脂酰胆碱类和甘油磷酸胆碱的相对丰度呈较强负相关，与油酸、8，11，14-二十碳三烯酸和羟孕烯醇酮的相对丰度呈较强正相关;但生物标志物与血小板和淋巴细胞相关较弱，但相关均有统计学意义。外周血常规的药效学指标结果和代谢组学结果均显示，归芎药对及其组成药味对乙酰苯肼和环磷酰胺诱导的血虚大鼠有养血补血作用，可调节紊乱的代谢通路向正常状态转归;归芎药对的养血补血整体作用优于其单味药，且当归的补血作用较川芎强。
　　（三）采用代谢组学策略研究归芎药对及其组成药味对血瘀大鼠的活血化瘀作用机制
　　首先，通过血液流变学和凝血功能指标检测，将归芎药对及其组成药味对急性血瘀大鼠的活血化瘀效应进行评价。然后，采用代谢组学策略，从血瘀大鼠血浆中初步鉴定得到3个潜在生物标志物，溶血性磷脂酰胆碱lysoPC(15∶0)、花生四烯酸和亚油酸。与正常组比较，血瘀大鼠血浆中花生四烯酸和亚油酸上调，lysoPC(15∶0)下调。在尿液中初步鉴定得到3个潜在生物标志物，分别为L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。与正常组比较，血瘀大鼠尿液中L-苯丙氨酸和L-酪氨酸上调，L-色氨酸下调。血浆和尿液中标志物主要参与亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、苯丙氨酸酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢和酪氨酸代谢。归芎药对及其组成药味均可调节紊乱的生物标志物及其代谢通路，使其向正常状态转归。药效学和代谢组学结果均显示，归芎药对的活血化瘀整体作用优于其单味药;川芎单味药的活血化瘀作用优于当归。通过药效学指标和内源性生物标志物的关联分析发现，血浆中3个标志物主要与全血黏度、全血还原黏度和纤维蛋白原含量呈较强相关;尿液中3个标志物与血液流变学和凝血功能指标整体相关较弱。研究结果表明药效学和代谢组学的结合在中药整体性药效评价、作用机理的阐明等方面具有很好的应用前景。
　　（四）归芎药对主要效应成分的网络药理学研究
　　采用网络药理学方法对归芎药对中9个主要入血效应成分（阿魏酸、绿原酸、咖啡酸、藁本内酯、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、丁基苯酞、正丁烯基苯酞）的分子作用机制进行分析，探讨其多成分、多靶点、多通路的相关关系。依据PharmMapper数据库构建多成分-蛋白网络;然后采用MAS和KEGG数据库获得靶蛋白的作用通路;最后，采用Cytoscape软件建立归芎药对成分-靶点-通路网络模型。结果发现，归芎药对中的9个效应成分涉及31个作用蛋白和54条作用通路;54条作用通路涉及神经-内分泌-免疫-血液系统中的多条;其中，3个芳香酸和6个苯酞内酯成分有10条共同作用通路，但两类成分的其它作用通路又各有侧重。文献研究和本课题组的代谢组学研究结果均证实了网络预测的可靠性。该结果体现了归芎药对的多成分、多靶点、多途径作用模式，为深入研究归芎药对的分子作用机制提供参考。

目录

声明

论文说明

摘要

前言

第一章 文献研究

第一节 药对的功效物质基础

参考文献

第二节 药对的配伍效应

参考文献

第三节 药对的现代研究策略与方法

参考文献

第四节 归芎药对的研究思路与方案设计

参考文献

第二章 归芎药对效应物质及其与补血活血效应的关联分析

第一节 基于UHPLC-TQ／MS法比较评价归芎药对中主要芳香酸类和苯酞内酯类成分的含量变化

参考文献

第二节 比较评价当归川芎配对伍用对血虚小鼠的补血作用

参考文献

第三节 比较评价当归川芎配伍对急性血瘀大鼠血流变及凝血功能的影响

参考文献

第四节 基于人工神经网络的归芎药对整体功效与化学物质关联性分析

参考文献

第三章 基于代谢及其组学和网络药理学的归芎药对补血活血作用机理研究

第一节 归芎药对及其组成药味中主要芳香酸类成分在血虚大鼠体内的代谢研究

参考文献

第二节 基于代谢组学的归芎药对对血虚大鼠的补血作用机制研究

参考文献

第三节 采用代谢组学策略研究归芎药对对急性血瘀大鼠的活血作用机制

参考文献

第四节 归芎药对中主要效应成分作用靶点预测及网络药理学研究

参考文献

结语

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

作者简介