华蟾素调控mir-494促胃癌BGC-823细胞凋亡作用机制的实验研究

摘要

研究目的:
　　蟾蜍自古就被作为攻毒类中药在抗肿瘤方面发挥重要作用。而自中华大蟾蜍阴干的蟾皮中提取的华蟾素注射液在临床被广泛应用于抗肿瘤治疗，并得到临床验证。对华蟾素作用机制的研究颇多，基本局限在mRNA及蛋白水平，尚不能作为靶标指导临床何时使用华蟾素有效。而miRNA是调控mRNA及其所表达蛋白的上游基因，许多研究推测miRNA可作为肿瘤治疗的靶点，故本研究旨在探讨miRNA参与华蟾素抑制胃癌细胞增殖促凋亡的机制，从而找出华蟾素作用靶点，以期指导临床个体化用药。
　　研究方法:
　　应用MTT法及流式细胞术等，检测华蟾素抑制人胃癌BGC-823细胞增殖的抑制率及促凋亡率率，证实华蟾素的有效作用后，采用基因芯片技术分析得华蟾素作用于BGC-823细胞48小时后miRNAs表达的变化谱，并获得一些候选的miRNAs分子，再对这些分子用实时定量PCR法检测其表达变化与对照组（生理盐水）的差别，而获得最显著差异表达的miRNA分子(miR-494)。
　　将miR-494 mimics转染到BGC-823细胞，并用实时定量PCR法检测转染miR-494mimics后BGC-823细胞中miR-494表达量的变化以验证转染效果。再用细胞增殖试验（CCK法）及流式细胞术分析转染miR-494 mimic满意的BGC-823细胞较对照组增殖及凋亡情况;生物信息学软件TargetScan，PicTar，and Miranda预测miR-494下游靶基因(BAG-1);Western-blot法检测转染miR-494 mimic后BGC-823细胞中BAG-1表达情况。用miR-494 mimics转染293T（人T抗原肾上皮细胞）细胞后与BAG-1培养，双荧光素酶试验检测转染miR-494 mimic后，BAG-1的表达与转染miR-494 mimic的关系，从而证实miR-494与BAG-1之间有否靶向关系。
　　实验结果:
　　1)随着药物质量浓度的增加，华蟾素对人胃癌BGC-823细胞的生长抑制作用明显增强，具有剂量、时间相关性。提示50mg/ml浓度72小时组对癌细胞抑制率最高46.35％，与其他浓度组及紫杉醇阳性对照组比较统计学有显著意义(P＜0.05)。流式细胞术检测华蟾素对BGC-823细胞作用48小时后细胞凋亡的影响，结果50mg/ml浓度组凋亡率为34.5±1.3，与对照组相比，差异具有显著性(P＜0.05)。说明华蟾素可以抑制BGC-823细胞的增殖，促进其凋亡。
　　2)华蟾素处理人胃癌细胞BGC-823细胞系48h后，与生理盐水对照组相比，共得到527个miRNAs表达变化的miRNAs表达谱，其中33个miRNA表达上调1.5倍以上，12个miRNA表达下调1.5倍以下。筛选后实时定量PCR验证12个miRNA分子(hsa-miR-181c-3p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-502-3p、hsa-miR-107、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-493、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-494、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-454-3p)得到:miR-494是与华蟾素最显著上调的miRNA分子。
　　3)将miR-494 mimics转染到BGC-823细胞后培养，用实时定量PCR法检测转染miR-494 mimics后BGC-823细胞中miR-494表达量的变化，结果随时间达72小时miR-494呈过表达状态，说明转染效果好。被转染miR-494 mimics的BGC-823细胞系培养，细胞增殖试验（CCK法）及流式细胞术分析与对照组相比可以显著抑制BGC-823细胞的增殖，并促进细胞的凋亡。
　　4)生物信息学方法预测BAG-1是miR-494下游靶基因，其3'UTR区存在miR-494结合区域。
　　5)Western-blot法检测BAG-1，与对照组及转染NC mimic后的BGC-823细胞中BAG-1表达量相比，转染miR494后BCG-823细胞中BAG-1表达量显著下降（*p＜0.05）。双荧光素酶试验检测转染miR-494 mimic后的293T细胞与BAG-1培养，结果显示转染miR-494mimic后BAG-1显著下调，即miR-494上调时BAG-1下调。
　　结论:
　　华蟾素抑制人胃癌BGC-823细胞增殖过程中伴随miRNAs表达谱的变化，华蟾素可能是通过诱导miR-494作用于BAG-1蛋白而参与抑制胃癌细胞增殖、促进细胞凋亡作用的。所以，我们推测miR-494可能成为华蟾素治疗胃癌的一个潜在的重要靶点。

目录

声明

摘要

前言

第一章 研究背景

第一节 华蟾素治疗胃癌研究的文献研究

1、中医理论基础

2、华蟾素抗肿瘤作用机制研究

3、华蟾素治疗胃癌的临床疗效

4、华蟾素治疗其它肿瘤的临床观察

5、讨论

参考文献

第二节 华蟾素注射液联合化疗治疗胃癌的临床疗效观察

1、资料与方法

2、临床疗效

3、不良反应

4、讨论

第三节 华蟾素抗胃癌细胞增殖促凋亡作用靶点的理论探讨

1．MicroRNA(miRNA)简介

2．miRNA作用机制及与疾病的关系

3．miRNA表达与恶性肿瘤关系

4．miRNA表达与胃癌发生、侵裘和转移有密切关系

5．miRNA可以作为中医药抗肿瘤的靶基因

6．华蟾素调控miRNAs抗胃癌细胞作用靶点的理论假说

参考文献

第二章 实验研究

第一节 华蟾素注射液对人胃癌细胞BGC-823增殖、凋亡的影响

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

第二节 华蟾素对胃癌BGC-823作用后MiRNA表达的基因芯片分析

1．实验样本

2．实验设备、试剂及方法

3、结果

第三节 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)实验验证华蟾素诱导的miRNA的表达

1．RNA抽提

2．RNA质量检测

3．进行cDNA合成

4、合成的cDNA用于实时定量PCR

5．讨论

参考文献

第四节 miR-494功能试验

1．细胞培养

2．Has-micro-494基因mimics设计与合成

3．siRNA的转染-为BGC-823细胞转染Has-micro-494 mimics

4．总RNA的提取

5．Real-time PCR------分析BGC-823转染miR-494 mimics后miR-494表达量

6．CCK8检测------了解转染micro-494 mimics细胞增殖抑制情况

7．细胞凋亡实验检测

8．Western blot检测

9．双荧光素酶检测试验

第五节 讨论

参考文献

全文小结

结语

参考文献

中英文缩略词对照表

攻读博士学位期间取得的学术成果

致谢

作者简介