重楼皂苷Ⅰ和吴茱萸碱对胃癌常用化疗药物的增敏作用及机制研究

摘要

第一部分重楼皂苷Ⅰ和吴茱萸碱在人胃癌组织上抗肿瘤活性检测和化疗增敏作用研究
　　研究背景和目的：
　　随着东西方医学的发展，中医药和化疗的联合使用在我国越来越常见。化学药物治疗有较明显的抗肿瘤增殖作用，但是其不可忽视的毒副作用不得不引起人们的关注和重视。在临床上治疗肿瘤的时候，化疗和中药联合不仅可以使化疗药引起的不良反应减轻，而且有些中药还能够协同化疗药物对肿瘤病灶的杀伤作用，起到化疗增敏的作用。本部分将对两种中药单体重楼皂苷Ⅰ和吴茱萸碱进行研究，在人新鲜胃癌标本上检测其抗肿瘤效果，并探讨其能否对胃癌常见化疗药物起到增敏作用和潜在机制。
　　方法：
　　(1)经病理学明确诊断为胃癌并且术前未接受过化疗或者放疗的初治患者纳入病例;
　　(2)完整记录患者的各项资料（姓名、年龄、性别、肿瘤部位、大小、淋巴结转移情况、病理类型）并对切除的新鲜肿瘤标本进行分类处理（一块置于100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的生理盐水中，另一块置于福尔马林中。并切取正常组织一块，置于福尔马林中）后标本放入冰盒中尽快运到肿瘤实验室。
　　(3)对新鲜标本预处理后使用体外药敏实验（HDRA），检测五种药物在特定浓度时对40例患者新鲜肿瘤标本的抑制率，五种药物的浓度分别为PPI(200 mg/ml)，EVO(200mg/ml)，Pt(20 mg/ml)，5-FU(300 mg/ml)，CPT-11(20 mg/ml);将药物处理组和对照组进行比较，计算抑制率，评价肿瘤组织对药物的敏感性并且评价新鲜肿瘤组织对中药单体的敏感性与患者的肿瘤特点有无相关性;
　　(4)在另外20例新鲜胃癌标本中同样采用HDRA研究中药单体对化疗药物的增敏、协同作用，以及对化疗耐药逆转的作用。采用的药物浓度为Pt(20 mg/ml)与PPI(200 mg/ml)或EVO(200 mg/ml)联用，并探讨原本对铂类(20 mg/ml)耐药（抑制率＜30％）的肿瘤组织，与PPI(200 mg/ml)或EVO(200 mg/ml)联用时，肿瘤组织对药物的敏感性是否升高;同样地5-FU(300 mg/ml)与PPI(200 mg/ml)或EVO(200 mg/ml)联用时，肿瘤组织对5-FU的敏感性是否升高，并探讨原本对5-FU(300 mg/ml)耐药（抑制率＜30％）的肿瘤组织，与PPI(200mg/ml)或EVO(200 mg/ml)联用时，肿瘤组织对5-FU的敏感性是否升高;探讨CPT-11(20mg/ml)与PPI(200 mg/ml)或EVO(200 mg/ml)联用时，是否有协同效果;
　　(5)利用计算机算出PPI、EVO与化疗药物Pt、5-FU共同作用时的CI数值。
　　结果：
　　①两种中药单体PPI和EVO可以抑制新鲜肿瘤组织，平均抑制率为20.64％±14.25％(PPI),21.14％±13.43％(EVO)。
　　②中药单体联合Pt作用结果:5种不同方案的平均抑制率分别为23.68％±14.32％(PPI),22.08％±13.61％(EVO),39.69％±19.57％(Pt),53.56％±18.80％(Pt+PPI),45.61％±16.29％(Pt+EVO)。当Pt与PPI合用时，抑制率比单独使用Pt高出约13.88％(P＜0.001，Paired Student'st test)，其中最明显地可以提高48.45％的抑制率。当Pt与EVO合用时，抑制率比单独使用Pt高出约5.92％(P=0.028，Paired Student's t test)，其中最明显地可以提高33.45％的抑制率。另外原本对铂类(20 mg/ml)耐药（抑制率＜30％）的肿瘤组织，与PPI(200mg/ml)或EVO(200 mg/ml)联用时，肿瘤组织对药物的敏感性都有所升高，肿瘤抑制率一般都大于30％。
　　③中药单体联合5-FU作用结果:5种不同方案的平均抑制率分别为23.68％±14.32％(PPI),22.08％±13.61％(EVO),52.23±21.78％(5-FU),53.10％±21.91％(5-FU+PPI),58.49％±25.50％(5-FU+EVO)。当5-FU与PPI合用时，抑制率比单独使用5-FU高出约0.87％(P＞0.05，Paired Student's t test)，其中最明显地可以提高17.36％的抑制率。当5-FU与EVO合用时，抑制率比单独使用5-FU高出约6.26％(P=0.017，Paired Student's t test)，其中最明显地可以提高23.63％的抑制率。
　　④PPI、EVO与化疗药物Pt、5-FU协同作用结果是，当抑制效应(Fa)=80％时，说明PPI与Pt，PPI与5-FU，EVO与Pt，EVO与5-FU都有抗肿瘤协同效应;当抑制效应(Fa)=50％时，PPI与Pt，EVO与Pt合用时CI数值小于1，具有协同效应。
　　⑤CPT-11(20 mg/ml)与PPI(200 mg/ml)或EVO(200 mg/ml)联用时，对肿瘤的抑制能力高于中药单体单独使用。但是当CPT-11与PPI、EVO联用时，抑制率与CPT-11单独使用时无显著性差异(P＞0.05，Paired Student's t test)。
　　结论：
　　①两种中药单体PPI和EVO可以抑制新鲜肿瘤组织，平均抑制率为20.64％±14.25％(PPI),21.14％±13.43％(EVO);
　　②PPI不仅可以在新鲜胃癌组织上增强铂类药物、5-FU的敏感性，还可以逆转铂类药物的耐药;
　　③EVO可以在新鲜胃癌组织上显著能增进铂类药物(P=0.028)和5-FU(P=0.017)的抗肿瘤作用，且EVO有逆转铂类药物耐药的特性。
　　本次研究从两种中药单体(PPI和EVO)、三种化疗药(Pt、5-FU、CPT-11)入手，通过三维微组织块培养药物敏感试验(HDRA)研究手段，探讨五种药物在新鲜切除的胃癌肿瘤组织上的敏感性。结果证明中药PPI和EVO具有潜在的抗肿瘤应用价值，并且可以增强胃癌一线用药Pt及5-FU的抗癌效果，能够逆转铂类药物耐药，为以后在胃癌上的临床用药提供依据。
　　第二部分 PPI和EVO化疗增敏机制探讨
　　研究背景和目的：
　　因为肿瘤存在异质性，不同患者之间必然会存在肿瘤对药物敏感性的差异，因此个体化药物治疗（customized/personalized medicine）这一新兴的治疗模式越来越受到人们的关注。个体化药物治疗试图通过提前检测药物发挥疗效所涉及的相关关键分子标志物(biomarker)来预测药物的疗效，从而帮助选择预测有效的药物。近些年来，个体化药物治疗正在逐渐成为恶性肿瘤化学药物治疗的发展趋势。已经有多个大样本临床试验证实分子标志与药物疗效之间的相关性，如与铂类疗效相关的标志ERCC1 mRNA、BRCA1 mRNA，与5-FU疗效相关的分子标志物TS mRNA和TFAP2E的甲基化状态，与CPT-11疗效相关的生物标志Topo1mRNA等。然而在中药方面，关于个体化选择中药（单体或方剂）的报道甚少，本部分将对三种化疗药物以及两种中药单体寻找疗效预测分子，并且探讨中药单体增敏化疗药物的潜在机制。
　　方法：
　　①经病理学明确诊断为胃癌并且术前未接受过化疗或者放疗的初治患者纳入病例;
　　②完整记录患者的各项资料（姓名、年龄、性别、肿瘤部位、大小、淋巴结转移情况、病理类型）并对切除的新鲜肿瘤标本进行分类处理（一块置于100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的生理盐水中，另一块置于福尔马林中。并切取正常组织一块，置于福尔马林中）后标本放入冰盒中尽快运到肿瘤实验室。
　　③对新鲜标本进行福尔马林固定处理后，尽快进行石蜡组织mRNA提取与纯化
　　④在所有的新鲜胃癌组织样品中（40例），检测四种基因ERCC1，TS，TOPO1以及APTX在用药前的mRNA表达水平。
　　⑤将新鲜胃癌组织与PPI(200 mg/ml)或EVO(200 mg/ml)共孵育3天，再通过RT-PCR的方法检测ERCC1，TS，TOPO1和APTX的mRNA表达水平，观察用药前后的变化。
　　结果：
　　①在所有的新鲜胃癌组织样品中（40例）检测到的四种基因的mRNA水平都以管家基因ACTB的mRNA水平为参考，ERCC1，TS，TOPO1以及APTX的mRNA表达水平分别为ERCC1:11.92(range0.33-42.32,95％ confidence interval(CI):9.12-14.72), TS:11.18(range0.13-46.53,95％ CI:7.56-14.80), TOPO1:6.93(range1.39-17.24,95％ CI:5.34-8.52),and APTX:3.33(range0.26-10.79,95％ CI:2.49-4.17)
　　②胃癌组织ERCC1 mRNA水平与铂类药物敏感性呈负相关(rho=-0.645，P＜0.001); TSmRNA水平与5-FU敏感性负相关(rho=-0.803，P＜0.001)。APTX mRNA表达水平与伊立替康敏感性呈负相关(rho=-0.376，P=0.017)，且与吴茱萸碱敏感性呈负相关(rho=-0.322，P=0.036)。
　　③中药单体PPI(200 mg/ml)或EVO(200 mg/ml)作用后3天，ERCC1mRNA的水平明显降低，并且PPI的作用效果非常明显(P=0.001，n=40)，EVO的作用效果较微弱(P=0.04，n=40)。
　　④中药单体PPI(200 mg/ml)或EVO(200 mg/ml)作用后3天，TS mRNA的水平明显降低，并且EVO的作用效果非常明显(P=0.017，n=40)，PPI的作用效果较微弱(P=0.047，n=40)。
　　⑤中药单体PPI(200 mg/ml)或EVO(200 mg/ml)作用后3天，TOPO1或APTX mRNA水平变化并未见显著性差异(P＞0.05)。
　　结论：
　　①胃癌组织ERCC1 mRNA水平与铂类药物敏感性呈负相关;TS mRNA水平与5-FU敏感性负相关。APTX mRNA表达水平与伊立替康敏感性呈负相关，且与吴茱萸碱敏感性呈负相关。
　　②通过药物作用前后基因表达变化的分析比较:重楼皂苷Ⅰ和吴茱萸碱能显著降低胃癌组织ERCC1mRNA表达水平;同时，吴茱萸碱和重楼皂苷Ⅰ能显著降低胃癌组织TSmRNA表达水平，这可能是此两种中药单体能增进铂类和5-FU药物敏感性的潜在机制。
　　这部分的研究结果显示:检测ERCC1、TS的mRNA表达水平，有利于预铂类药物、5-FU为基础的化疗方案的敏感性;同时APTX可以成为EVO敏感性预测的生物标志。并且，PPI和EVO增强抗癌药物Pt和5-FU对胃癌的化疗敏感性也许是得益于中药单体可以下调ERCC1及TS的mRNA表达水平。本部分研究证实检测ERCC1、TS、APTX具有预测铂类药物、5-FU、EVO敏感性的价值，重楼皂苷Ⅰ和吴茱萸碱通过下调ERCC1、TS起到增强铂类药物、5-FU的抗肿瘤作用，为临床上该方案的选择提供理论基础和指导价值。

目录

声明

摘要

绪论

参考文献

第一部分 重楼皂苷Ⅰ和吴茱萸碱在人胃癌组织上抗肿瘤活性检测和化疗增敏作用研究

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二部分 PPI和EVO化疗增敏机制探讨

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

缩略词表

攻读博士期间取得的学术成果

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