从自噬调控探讨清热活血方及芹菜素对肺腺癌细胞A549的作用机制

摘要

在世界范围内，每年因肺癌死亡者约占因癌症死亡总人数的28％，居于因癌症死亡原因的首位。我国的肺癌发病率以每年11％速度递增。肺癌由于其生物学特性复杂，及现代医学治疗手段的局限性，肿瘤的综合治疗模式已成为现在及未来肺癌临床干预的必然趋势。近年来，中医药及其提取物在肺癌综合治疗中的作用引起越来越广泛的关注。本研究在中医温病学理论指导下，以清热活血法为主要治法，选用临床验方加味苇茎汤及有效抗肿瘤成分芹菜素进行了系统、深入地文献研究、理论研究和实验研究。
　　第一部分:文献研究。从病名、病因病机、治则治法方面阐述了古代中医学对肺癌的认识，进而对中医药治疗肺癌的现状进行了分析，总结强调:中医药对肺癌的治疗作用，是通过改善患者整体状况、抑制肺癌瘤体生长及转移、并发症调治、协同西医治疗等多方面治疗而发挥的综合作用。
　　第二部分:理论研究。首先，对肺癌初期热瘀互结证型及清热活血法进行了探析。认为肺癌初期正气受损尚轻，邪热实积较盛，最终导致瘀热痰互结而形成肿物，故应施予清热活血法为主进行治疗。其次，对选方用药进行了理论与实践依据的论述，着重阐述了以下三点:其一，加味苇茎汤治疗肺癌的临床应用及实验研究成果;其二，芹菜素可通过多种途径发挥抗肿瘤作用;其三，自噬在肺癌发生发展及治疗过程中具有重要意义。
　　第三部分:实验研究。运用现代分子生物学技术，从细胞自噬调控的角度，探讨以清热活血为主要功效的加味苇茎汤及其成分芹菜素对肺腺癌A549细胞的影响。研究结果表明，该方法在抑制肿瘤细胞生长、细胞周期阻滞、细胞凋亡和自噬相关信号转导等方面均有良好作用。
　　第一，生长抑制:MTT结果显示，加味苇茎汤含药血清及芹菜素均能抑制A549细胞生长增殖，并呈现一定的量效、时效关系。
　　第二，促进凋亡:通过药物作用，荧光显微镜下可见凋亡小体出现，表明两药均能诱导肺癌A549细胞的凋亡，提示加味苇茎汤含药血清及芹菜素均可通过诱导细胞凋亡途径抑制肺癌A549细胞的增殖而发挥治疗作用。芹菜素作用A549细胞后，脱落细胞数、凋亡小体明显多于含药血清组，且根据流式细胞仪检测细胞凋亡率，芹菜素组诱导细胞凋亡作用明显优于含药血清组(P＜0.01)，进一步证明了芹菜素可促使肺癌A549细胞凋亡明显增加，与增殖抑制实验数据相符，提示芹菜素主要是通过诱导凋亡方式抑制A549细胞的生长。
　　第三，周期阻滞:两药对A549细胞周期均产生了影响，与空白对照组比较，周期分布有了明显变化（P＜0.05）。但两药对A549细胞生长相关指标的具体影响差异明显:药物作用相同时间后，芹菜素50μmol/L组（最高浓度）对细胞的抑制作用明显高于10％含药血清组（最高浓度）(P＜0.01)，说明在本实验浓度梯度设置范围内，芹菜素对A549细胞的增殖抑制作用优于加味苇茎汤含药血清;在周期阻滞方面，加味苇茎汤含药血清主要通过将A549细胞阻滞于G2期，阻止细胞进行有丝分裂来发挥抗肿瘤作用;芹菜素对细胞也有G2期阻滞作用，但未呈现量效时效关系。
　　第四，信号通路抑制:加味苇茎汤含药血清、芹菜素均能够抑制A549细胞内mTOR、PI-3K蛋白的高表达(P＜0.01)。
　　本研究在细胞、分子水平上阐明了清热活血方加味苇茎汤及芹菜素抗肺腺癌A549的作用机制，深入探讨了中医药治疗肺癌的主要作用靶点，从而为临床治疗早期肺癌提供了可靠的实验室依据。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 文献研究

1．古代中医对肺癌的认识

1．1 病名释义

1．2 病因病机

1．3 治则治法

2．中医药治疗肺癌的现状分析

2．1 整体论治

2．2 针对瘤体治疗

2．3 治疗常见并发症

2．4 中西联合，协同增效

第二部分 理论研究

1．热瘀互结证与清热活血法探析

1．1 热瘀互结是肺癌初期的重要病机

1．2 清热活血法是肺癌初期的重要治法

2．选方用药理论及实践依据

2．1 加味苇茎汤临床应用及实验研究

2．2 芹菜素抗癌机制研究

2．3 自噬与肺癌发生发展有重要关系

第三部分 实验研究

实验一 加味苇茎汤含药血清制备及细胞培养

(一)含药血清制备

(二)细胞培养

实验二 加味苇茎汤含药血清及芹菜素对肺腺癌A549细胞生长的影响

(一)光镜观察加味苇茎汤及芹菜素对肺腺癌A549细胞生长形态的影响

(二)MTT法检测加味苇茎汤含药血清及芹菜素对肺腺癌A549细胞生长抑制率的影响

(三)实验讨论

实验三 加味苇茎汤含药血清及芹菜素对肺腺癌A549细胞凋亡的影响

(一)免疫荧光法检测加味苇茎汤含药血清及芹菜素对肺腺癌A549细胞凋亡形态的影响

(二)流式细胞术检测加味苇茎汤含药血清及芹菜素对肺腺癌A549细胞凋亡率的影响

(三)实验讨论

实验四 加味苇茎汤含药血清及芹菜素对肺腺癌A549细胞周期的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 实验讨论

实验五 加味苇茎汤含药血清及芹菜素对肺腺癌A549细胞自噬相关信号分子PI3K、mTOR的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 实验讨论

实验研究结果总结分析

1 选方用药依据

2 指标选定意义

3 数据分析讨论

第四部分 小结与展望

参考文献

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢