姜黄素对肝纤维化的保护作用及表观遗传学机制

摘要

背景：
　　姜黄素(Curcumin)为姜黄的主要活性成分之一，具有抗肝纤维化(hepaticfibrosis，HF)作用，但具体机制不详细，可能与抗氧化、抗炎、清除自由基有关。现有研究表明，在HF组织中，纤维化相关基因的甲基化状态及表达水平均表现出较明显的差异。但姜黄素是否能够通过影响肝纤维化相关基因的甲基化状态来发挥抗HF的作用尚不清楚。本课题拟在体内外模型中探讨姜黄素对肝纤维化相关基因的甲基化状态的影响，可望发现姜黄素抗HF的新机制。
　　方法：
　　1.实验动物与分组:SPF级雄性C57BL/6小鼠18只，4-6周龄，随机分为3组:对照组(FC)、模型组(FM)和姜黄素组(FJ)，每组6只。
　　2.肝纤维化模型的建立及姜黄素干预:FM和FJ组按0.6 ml/kg的剂量腹腔注射四氯化碳(CC14)，每周2次，连续6周;FC组腹腔注射等体积的橄榄油作为对照。同时，FJ组每只鼠按姜黄素200 mg/kg剂量灌胃，每日一次，连续6周，FC和FM组灌胃等体积的PBS作为对照。
　　3.标本收集:末次CCl4腹腔注射48 h后处死小鼠，采集外周血和肝组织，分别检测小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶(AST)水平和肝脏病理学形态。肝脏组织提取DNA，检测甲基化;提取RNA和蛋白，Real time PCR和Westen Blot检测α-SMA、Col1a1和DNMT的表达。
　　4.甲基化谱的筛选及鉴定:通过Roche-NimbleGen小鼠MeDIP-chip技术，筛选三组小鼠肝脏组织的甲基化差异基因，进一步做gene ontology(GO)分类和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)信号通路分析;对8个代表性基因（Camk4、Fgfr3、FZD10、Gpx4、Hoxd3、Nfkb2、Prkcb、Tcfeb）进行MeDIP-qPCR验证。
　　5.姜黄素处理大鼠肝星状细胞（HSC-T6细胞），分为三组:对照组，TGF-β1诱导组，姜黄素处理组;检测细胞增殖、细胞周期，α-SMA、Col1a1和DNMT的表达，Camk4、FZD10、Gpx4和Hoxd3基因甲基化。
　　6.所有数据的统计分析使用SPSS16.0软件，数据的统计描述使用均数±标准差，两组间的差异分析使用t检验或非参数检验，三组及以上的差异分析使用单因素方差分析，P＜0.05表示具有统计学差异。
　　结果：
　　1.小鼠血清ALT与AST水平:FC、FM和FJ三组小鼠ALT分别为:（23.0±1.55）U/mL、（2485.8±362.85）U/mL、(386.93±33.02) U/mL; AST分别为:(100.8±9.98) U/mL、(1593.8±303.2) U/mL、(322.2±47.56) U/mL，FM组小鼠血清ALT及AST水平较FC组明显增高，而姜黄素能明显降低肝纤维化小鼠血清ALT及AST水平。
　　2.肝脏组织形态:FC组肝小叶和汇管区的形态结构正常，肝细胞完好，汇管区和汇管区四周未出现小胆管和增生的纤维组织;FM组见肝细胞大量坏死，小叶结构紊乱，并伴有炎症细胞浸润，肝组织内胶原纤维明显增多，肝小叶纤维间隔形成;FJ组可见肝小叶结构较清晰，肝组织纤维沉积较FM组明显减轻。
　　3.α-SMA、Col1a1和DNMT1表达:Real time PCR和Western blot提示，FM组α-SMA、Col1a1和DNMT1表达较FC组明显增多，FJ组与FM组比较，β-SMA、Col1a1和DNMT1表达均下降。
　　4.甲基化芯片结果:根据FC组低甲基化，FM组高甲基化，共筛选934个甲基化差异基因。根据FJ组低甲基化，FM组高甲基化，选择了甲基化差异基因共550个。其中有75个属于两者重合部分，完成GO、KEGG信号分析，可见其主要涉及细胞过程调节、生物学过程调节、细胞代谢过程、发育过程等;信号通路最常见的依次为:肿瘤相关通路、NK-kappa B信号、MAPK信号、Wnt信号通路、NK细胞介导的细胞毒作用等。在75个差异基因中，根据Peak Score＞2，Peak MValue＞0.7，基因启动子类型为HCP或ICP，基因类型包括细胞周期、损伤修复、增殖及凋亡等指标，共选择代表基因8个(Camk4、Fgfr3、FZD10、Gpx4、Hoxd3、Nfkb2、Prkcb、Tcfeb)，然后做MeDIP-qPCR验证，测定结果和芯片相同(P＜0.05)，表明芯片具有较高的可靠性。
　　5.体外实验:姜黄素处理大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞，可抑制TGF-β1诱导的细胞增殖，使细胞周期G2/M期比例减少，降低α-SMA、Col1a1和DNMT表达;逆转Camk4、FZD10、Gpx4和Hoxd3基因高甲基化状态。
　　结论：
　　1.姜黄素对肝纤维化有保护作用。
　　2.姜黄素可能通过对DNA甲基化的调节而发挥抗肝纤维化作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 材料与方法

第二章 实验结果

第三章 讨论

结论

参考文献

文献综述1 肝纤维化的发病机制及诊疗进展

文献综述2 姜黄素抗肝纤维化作用研究概况

文献综述3 肝星状细胞的表观遗传学修饰

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

作者简介