黄肉猕猴桃类胡萝卜素合成相关基因的克隆与表达分析

摘要

果肉色泽是中华猕猴桃(Actinidia chinensis)果实品质评价及种质改良的重要经济性状,控制色泽的基因在中华猕猴桃果实整个生长发育过程尤其是成熟阶段转色发挥重要作用。本文以黄肉型中华猕猴桃‘金丰’为研究材料，采用荧光定量PCR技术对类胡萝卜素合成相关基因的表达进行检测，并对其相关基因进行克隆与表达分析，可为阐明中华猕猴桃果肉色泽发育的分子机制奠定基础，亦为猕猴桃分子育种与种质创新提供理论依据。主要研究结果如下：
　　1.基于前期分析测定中华猕猴桃果实发育期间14个不同时期的果肉色素含量，选取8个重要的转色时期提取果肉RNA，利用实时荧光定量PCR技术对黄肉型中华猕猴桃-金丰-果实发育过程中果肉类胡萝卜素合成相关的11个差异基因进行了表达分析，并与色素做相关性分析，各基因做聚类分析，结果表明，11个基因在果肉中均有表达，但各基因表达水平各不相同；从色素与相关差异基因相对表达量的相关性分析来看，类胡萝卜素含量与Unigenes11266、Unigenes23885、Unigenes2673三个基因相对表达量呈显著相关；聚类分析结果显示，基因Unigenes11266和Unigenes23885、基因CL1511和CL10798分别被聚为一类，且与其他基因明显分开，基因CL10467与它们距离最近，同时基因Unigenes12775与Unigenes23823被聚在一起。综合分析表明，Unigenes11266、Unigenes23885可能是类胡萝卜素合成的关键基因。此外，基因Unigenes12775、CL10467、CL1511、CL10798、Unigenes2673可能与类胡萝卜素合成关系密切。
　　2.利用基因克隆技术对黄肉型中华猕猴桃-金丰-中编码番茄红素β-环化酶的Unigenes11266、p450基因家族的CL1511、CL10467三个基因进行克隆，并将其分别命名为AcLCYB-1，AcP450-1, AcP450-2。研究结果如下：
　　（1）AcLCYB-1具有一个1482bp的开放阅读框，编码493个氨基酸；将该蛋白序列比对到红阳猕猴桃基因组草图中Achn347121蛋白，相似性达到99％，仅有1个氨基酸位点存在差异；氨基酸序列中包含一些植物Lcyb的特征序列，都含有一段FLYAMP序列，都存在FAD/NAD(P)结合区；系统进化树分析显示，该蛋白与猕猴桃属(Actinidia)的中华猕猴桃(A.chinensis)、美味猕猴桃(A.deliciosa)及属于浆果的葡萄和草莓的LCYB蛋白距离较近，而与辣椒、烟草、拟南芥等距离较远。
　　（2）AcP450-1具有一个1449bp的开放阅读框，编码482个氨基酸；将该蛋白序列比对到红阳猕猴桃基因组草图中Achn313551蛋白，两序列相似性达到99%，中间部分多了33个氨基酸，另外有3个氨基酸不一样；氨基酸序列符合P450家族中特征性血红素结合位点序列、螺旋K区、螺旋I区的基本特征；系统进化树分析显示，该基因与可可、拟南芥、丹参等距离较近，而与葡萄却距离较远。
　　（3）AcP450-2具有一个1458bp的开放阅读框，编码485个氨基酸；将该蛋白序列比对到红阳猕猴桃基因组草图Achn223051蛋白，相似性达到100%；氨基酸序列符合P450家族中螺旋K区及特征性血红素结合位点序列等p450家族的基本特征；系统进化树分析显示，该基因则与马铃薯、葡萄、蓖麻等距离较近，而与可可、拟南芥等距离很远。

目录

声明

前言

第一章 文献综述

1.1 植物类胡萝卜素研究进展

1.1.1类胡萝卜素代谢途径

1.1.2类胡萝卜素合成途径中主要酶及基因

1.2猕猴桃果肉颜色研究概述

1.2.1 绿肉猕猴桃

1.2.2 红肉猕猴桃

1.2.3 黄肉猕猴桃

1.3 RNA-Seq测序技术及DGE研究进展

1.3.2 RNA-Seq及DGE在动植物中的应用

1.4本研究的内容、目的和意义

第二章 类胡萝卜素合成相关基因的实时定量表达分析

2.1 材料

2.1.1 样品采集和处理

2.1.2 试剂与仪器

2.2 方法

2.2.1‘金丰’猕猴桃果肉RNA的提取与质量检测

2.2.2 cDNA 的合成和实时定量 PCR

2.2.3数据分析

2.3 结果与分析

2.3.1‘金丰’猕猴桃果肉RNA的提取与引物筛选

2.3.2 合成相关差异基因熔解曲线

2.3.3 合成相关差异基因实时荧光定量表达分析

2.3.4 类胡萝卜素含量与相关基因表达量的相关性分析

2.3.5 合成相关基因的聚类分析

2.4小结与讨论

第三章基因AcLCYB-1，AcP450-1, AcP450-2的克隆与序列分析

3.1材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 主要试剂

3.1.3第一链cDNA合成

3.1.4 PCR扩增获得目的基因片段

3.1.5 回收纯化的PCR产物

3.1.6 T载体连接

3.1.7连接产物的转化及重组质粒的蓝白斑筛选

3.1.8基因片段测序

3.1.9生物信息学分析

3.2 结果与分析

3.2.1 基因克隆PCR结果

3.2.2 AcLCYB-1基因克隆及序列分析

3.2.3 AcP450-1基因克隆及序列分析

3.3 小结与讨论

第四章 总结与展望

参考文献

致谢

作者简历