烟草orf25、atp9基因的RNAi载体构建及遗传转化

摘要

杂种优势的利用可以有效地使烟草实现高产、高抗、优质的育种目标。目前，培育雄性不育系是获取杂种烟草最有效的途径。本文以烟草雄性不育相关基因orf25和atp9为对象，通过RNA干扰技术，分别构建了烟草orf25、atp9基因的RNAi表达载体pCAMBIA1301-orf25-RNAi和pCAMBIA1301-atp9-RNAi，并通过农杆菌介导烟草遗传转化技术获得转基因烟草苗，以探讨烟草雄性不育相关基因orf25、atp9的功能及其在烟草雄性不育形成中的作用，为选育烟草雄性不育系植株奠定基础。主要研究结果如下：
　　1、烟草orf25、atp9基因干扰片段的获得：依据实验室保存的orf25、atp9基因全长cDNA序列，分别设计特异性引物，扩增orf25、atp9基因的正、反义干扰片段：orf25基因扩增片段为606bp，atp9基因扩增片段为239bp。
　　2、烟草orf25、atp9基因的RNAi表达载体的构建：根据RNAi表达载体构建原则，将长度为606bp的orf25基因的正、反向干扰片段插入到大小为190bp的linker片段的两侧，长度为239bp的atp9基因的正、反向干扰片段插入到linker片段的两侧，分别构成含linker间隔片段稳定发夹结构的RNA干扰片段。以pET30a和pCAMBIA1301为桥梁载体，成功的构建orf25、atp9基因的RNA干扰表达载体pCAMBIA1301-orf25-RNAi和pCAMBIA1301-atp9-RNAi。
　　3、烟草遗传转化条件的建立：农杆菌GV3101侵染烟草叶片最适宜的侵染浓度OD600值为0.5；最适宜的侵染时间为8分钟；烟草预培养最佳时间为3天；侵染后28℃暗培养最佳时间为3天；抗性筛选物卡那霉素最佳浓度为80 mg/L；农杆菌抑制剂头孢霉素的最佳浓度为400 mg/L。
　　4、烟草转基因苗的获得：利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-orf25-RNAi和pCAMBIA1301-atp9-RNAi分别转入烟草保持系中烟90中，经抗性筛选以及分子检测最终获得35株转pCAMBIA1301-orf25-RNAi烟草植株，其中阳性烟草有18株，转化率为51.4%；获得41株转pCAMBIA1301-atp9-RNAi烟草植株，其中阳性烟草有20株，转化率为48.8%。

目录

声明

第一章 文献综述

1 植物雄性不育性研究

2 RNA干扰技术及其在烟草中的应用研究

3 烟草遗传转化技术

4 本研究的目的和意义

5 研究内容和技术路线

第二章 材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

第三章 结果与分析

1 orf25、atp9基因RNAi载体构建

2 RNAi表达载体转化农杆菌的鉴定

3 烟草遗传转化体系的优化

4 转基因烟草植株的获得

5 转基因烟草PCR检测

结论

讨论

1 RNA干扰载体的构建

2根癌农杆菌介导烟草遗传转化

3 下一步的研究设想

参考文献

致谢