小鼠心脏发育过程中钙循环相关调节蛋白的表达与分布

摘要

兴奋收缩耦联对心肌细胞功能的发挥有重要意义。成熟的心肌细胞有其自身的特性,在成熟的心肌细胞中,质膜(PM)上的L型钙离子通道与肌浆网(SR)上的Ryanodine受体(RyR)并列紧密排列。当动作电位(Aps)引起PM上的L型钙离子通道开放时,通过通道进入的Ca2+会促发RyR将SR中大量的Ca2+释放出来。在心脏成熟过程中,随着心肌细胞的发育进程,上述的这些功能会发生很大变化。然而,至目前为止,关于哺乳动物心肌细胞胚胎发育过程中Ca2+循环调控蛋白特性的研究还很少,许多问题还有待澄清。本研究用免疫染色以及实时荧光定量PCR的方法来研究小鼠心肌细胞从胚胎发育早期(E9.5)到成年期这整个过程中Ca2+循环调节蛋白的动态表达情况和亚细胞分布。实验结果如下:
　　 L型钙离子通道的两种主要亚基α1C和α1D在mRNA水平上都伴随着心脏节律性收缩的出现(E9.5)而出现,但两者的变化趋势有所不同,α1C亚基在E11.5天时回落,而在E14.5天出现了一次瞬时性的增高,随后又回落到原先的水平。而α1D亚基在胚胎期的表达出现了两次较大的一过性上升,一次出现在E10.5,一次在E15.5,随即回落到较低的水平。在蛋白表达区域上,二者却十分相似,这二种L型钙离子通道始终在心室肌细胞的胞质和胞膜中清晰可见,在成年阶段的心室肌细胞中主要沿T管和细胞核分布。L型钙离子通道主要心肌细胞中表达,而在早期的流出道,房室管,以及由此衍生而来的房室瓣膜、血管流出道瓣膜、尚未成熟的心室肌小梁、室间隔以及小部分血管内皮中的内皮细胞和间充质细胞都未检测到该类蛋白的表达。
　　 与L型钙离子通道相似,T型钙离子通道的两种亚基α1G和α1H在mRNA水平的出现时间同L型钙离子通道是一致的(E9.5),但两种亚基的表达趋势相反,α1G亚基随着小鼠的生长发育其表达量也随之升高,并在成年期稳定在一个较高的水平;而α1H亚基除了在E12.5的表达出现了一个小的回落之外,其余时间均维持在较高的水平,但出生后的α1H亚基mRNA的表达量却远远低于胚胎期。T型钙离子通道的两种亚基在小鼠胚胎心脏发育过程中的表达模式大致相似,在心室肌细胞中,两种T型钙离子通道都主要分布在细胞膜上而在T管中分布较少。在整个心脏结构上,其主要分布在腔室壁、腔室间隔、以及肌小梁的心肌层,并且自始至终都稳定表达;而在慢速传导区域的流出道和房室交界的组织(房室瓣,主动脉瓣,肺动脉瓣)中都没能检测到T型钙离子通道蛋白的阳性信号,这提示T型钙离子通道对于心肌细胞的发育以及心脏快速传导区域的形成有着很重要的作用。
　　 钠钙交换器(NCX1)在E13.5天出现一个转录高峰,随后其成年期的转录水平低于胚胎早期(E10.5),约只有E13.5天的20％。NXC1存在于心室肌细胞中,在内皮细胞以及间充质细胞中并未检测到其表达。另一种重要的心肌钙循环调节蛋RyR2的mRNA在E9.5天就可被检测到,并伴随着心肌细胞的成熟其表达量逐渐增加。RyR2稳定表达于腔室壁、肌小梁的心肌层等部位,而在房室管的间充质细胞,房室瓣以及室间隔的内皮细胞中缺如。
　　 综上所述,分布在心脏中的钙离子循环调节蛋白虽然在mRNA水平的表达各有不同,并且其表达时间亦有差异,但是其在心脏的分布区域却有共同之处:在心肌细胞的胞膜区域高表达,而在非心肌细胞区域表达缺失,这对于进一步研究钙循环相关调节蛋白与心肌细胞发育的相互关系提供了一定的实验依据。