天然冰片、合成冰片及薄荷脑对P-糖蛋白的影响及其机制研究

摘要

一、目的
　　 研究天然冰片、合成冰片、薄荷脑对P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)功能及表达的影响,并评价天然冰片与合成冰片的区别。为这三种活性成份的配伍应用及其新药研发提供依据。
　　 二、方法
　　 1.细胞毒性实验
　　 采用MTT法进行细胞毒性实验,使实验过程中采用的细胞活性>98％。
　　 2.Rhodamine123(Rh123)积累与外排实验
　　 用酶标仪测定P-gp底物Rh123在Caco-2细胞中积累的变化,再进一步测定其外排的变化,以确定天然冰片、合成冰片、薄荷脑对P-gp的功能的影响。
　　 3.P—gp与MDR1 mRNA的表达测定
　　 采用Western blot与RT-qPCR方法分析天然冰片、合成冰片、薄荷脑对Caco-2细胞中P-gp与MDR-1 mRNA表达水平的影响。
　　 三、结果
　　 1.细胞毒性实验
　　 确定了本实验条件下各自的实验浓度范围(与Caco-2细胞孵育48h后,细胞活性>98％):天然冰片(5-65μM)、合成冰片(5—35μM)及薄荷脑(2-5μM)。
　　 2.Rh123积累与外排实验
　　 药物与Caco-2细胞孵育48h后,细胞中Rh123的积累量与冰片的浓度呈正相关。天然冰片(5—35μM)或合成冰片(10-35μM)能显著增加Rh123的积累量。
　　 药物与Caco-2细胞孵育1h后,低浓度(5、10μM)的天然冰片与合成冰片对Rh123的外排没有影响。高浓度(20、35μM)的天然冰片或合成冰片使Rh123的外排量显著增加。
　　 薄荷脑(2、5、10、20μM)对细胞中Rh123的量没有显著性影响。
　　 3.P-gp与MDR1 mRNA的表达测定
　　 天然冰片或合成冰片(35μM)与Caco-2细胞孵育48h后,Caco-2细胞中P-gp与MDR1 mRNA的表达量显著下降。天然冰片与合成冰片的作用未见显著性差异。薄荷脑(5μM)对细胞中P-gp与MDR1 mRNA的表达量没有显著性影响。
　　 四、结论
　　 1.天然冰片或合成冰片可以通过抑制MDR1 mRNA的表达水平而下降P-gp的水平,从而影响P-gp转运功能。
　　 2.实验中薄荷脑对P—gp的表达与功能均无明显作用,提示其不是P-gp抑制剂。
　　 3.天然冰片或合成冰片与P-gp底物合用可能会产生药物相互作用,临床效果有待进一步验证。
　　 4.天然冰片或合成冰片可能成为多药耐药抑制剂,辅助肿瘤化疗。