利用微卫星标记分析球花石斛的遗传多样性鉴定其药材的地理来源

摘要

球花石斛(Dendrobium thyrsiflorum Rchb.f)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)药用植物,球花石斛的茎段可以加工成一种重要的传统中药“黄草石斛”,此中药具有很好的疗效,具有提高免疫力、益胃生津、滋阴清热、润肺止咳等功能。此外,球花石斛由于花姿优美,还可以用作装饰品。然而,由于其在药学及园艺业上的广泛应用,导致了球花石斛野生资源的急剧减少。
　　 研究一个物种的遗传多样性及遗传结构是保护该物种的前提,因为它们反映了该物种的生存及资源现状。目前,由于仍不了解球花石斛居群的遗传多样性,这给球花石斛野生资源的保护带来极大的困难。本文采用微卫星(SimpleSequence Repeat,SSR)分子标记技术对其野生居群遗传多样性及遗传结构进行了研究,探讨野生球花石斛日益减少的内在原因,从而为其野生资源的保护、药材的道地性和合理开发利用提供科学依据。鉴别出中国药材市场上球花石斛的地理来源对于保护其野生资源及确保“黄草石斛”的质量至关重要。本文采用微卫星标记结合贝叶斯统计学方法来鉴别12个球花石斛的商品形式(“黄草石斛”)的地理来源。
　　 本研究通过磁珠富集法开发球花石斛微卫星。在含有微卫星的序列中选取了24条设计引物。以采自中国南部地区的5个不同表型的球花石斛基因组DNA为材料,在同样的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)条件下对这些引物进行扩增,以检测引物扩增产物多态性。这24对引物中,14对引物可用于球花石斛的遗传特点分析。
　　 采用本研究所开发的14个多态性微卫星位点,对来自中国、缅甸、老挝、泰国及印度的5个居群共136个球花石斛个体进行遗传多样性及遗传结构分析。在物种水平上,14对微卫星引物共检测到136个等位基因,平均观察等位基因数(Na)为9.71,平均有效等位基因数(Ne)为6.83,Shannon多样性指数平均为2.02,平均期望杂合度(He)为0.85。在群体水平上,各群体内的有效等位基因数范围为4.45～6.83,期望杂合度(He)值变动范围为0.76～9.85,表明球花石斛野生群体中存在较高的遗传多样性。基因分化系数(Fst)的范围是0.06-0.22,平均值为0.12,即群体间存在12％的遗传变异,说明尽管绝大部分遗传变异存在群体内,群体间遗传分化水平仍相对较高。
　　 在球花石斛5个居群14对微卫星引物数据基础上,分别采用基于贝叶斯概率论的两种相关软件GENECLASS2.0及STRUCTURE2.2,对中国药材市场上由球花石斛加工而成的12个“黄草石斛”样品的地理来源进行鉴别,结果显示:4个样品来自缅甸居群,4个样品来自老挝居群,2个样品来自中国居群,1个来泰国居群,1个样品来自印度居群。研究结果表明缅甸和老挝是中国药材市场上球花石斛主要来源地。同时也说明缅甸及老挝两国的球花石斛野生资源很可能遭受到过度采挖,因此这两个国家迫切需要采取有效措施保护该药用植物。