贪噬菌Variovorax boronicumulans J1降解烟碱类杀虫剂噻虫啉机制的研究

摘要

本文主要研究了贪噬菌Variovorax boronicumulans Jl降解烟碱类杀虫剂噻虫啉(THI)的机制,克隆了V.boronicumulans J1的腈水合酶基因及其激活蛋白基因,并在Escherichia coli BL21(DE3)中表达了具有THI水解活性的腈水合酶。本实验室前期研究发现贪噬菌V.boronicumulans J1可降解THI,液相色谱和质谱联用分析显示,转化产物的分子量为271(M+H2O),与酰胺-噻虫啉(THI amide)的分子量一致,表明J1菌株可以作用于THI的氰基基团使其转化为酰胺基,与腈水合酶的作用方式一致。
　　本文进一步研究了在该过程中其关键作用的腈水合酶,利用兼并引物、反向PCR等方法从V.boronicumulans J1基因组上克隆出2.6Kb长的DNA序列,它包含完整的腈水合酶基因及其下游的激活蛋白基因。其中腈水合酶基因全长1304bp,包括长642bp的α亚基和长666bp的p亚基;激活蛋白基因全长378bp。对腈水合酶基因的核酸序列进行生物信息学分析,确定该腈水合酶为钴离子型腈水合酶。将腈水合酶基因和激活蛋白基因一起或单独与表达载体PET-28a连接并导入宿主菌E.coli BL21进行异源表达。SDS-PAGE和Western Blot检测到目的蛋白的表达。
　　过表达菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-NHase和E.coli BL21(DE3)-pET28a-NHJ的静息细胞均可转化THI,且后者显示比前者有更高的腈水合酶活性;而不含腈水合酶基因的空质粒E.coli BL21(DE3)-pET28a则不能将转化THI。转化液经HPLC分析显示,产物的保留时间和THI amide相同;质谱分析显示转化产物与THI amide的分子量相同;核磁共振分析表明该产物与THI amide的碳谱和氢谱数据相同。上述结果表明,V.boronicumulans J1菌株的腈水合酶是将THI水解为THI amide的关键酶,其下游的激活蛋白基因编码对腈水合酶有活化功能的激活蛋白。腈水合酶底物特异性研究表明,含表达蛋白腈水合酶的E.coli BL21(DE3)菌株还可将3-氰基吡啶转化为烟酰胺。相关V.boronicumulans J1代谢THI及其腈水合酶的研究目前尚未见有报道,本文首次开展了V.boronicumulans J1腈水合酶的研究,对于微生物代谢和降解THI及其它腈类化合物具有重要的价值。

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ABSTRACT

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缩写

第一章 前言

一、烟碱类农药概述

二、烟碱类杀虫剂THI的代谢研究

(一) TH在植物和动物中的代谢

(二) THI的土壤代谢

三、腈水合酶的研究

四、本论文的研究思路

第二章 V.boronicumulans J1腈水合酶基因的克隆的研究

1 实验材料

1.1 菌株和质粒

1.2 培养基的配制

1.3 主要试剂及来源

1.4 主要仪器设备及其来源

1.5 主要溶液配制

1.6 酶

1.7 PCR引物

1.8 其他材料

1.9 菌株培养与保藏

2 实验方法

2.1 基因组DNA的提取

2.2 设计引物进行PCR扩增

2.3 PCR产物纯化回收

2.4 PCR产物装TA克隆

2.5 感受态细胞制备及转化

2.6 阳性克隆的筛选

2.7 测序验证

3 实验结果

3.1 V.boronicumulans J1基因组的提取

3.2 PCR结果

3.3 阳性克隆的筛选结果

3.4 测序、拼接及序列比对结果

3.5 腈水合酶种类考察结果

4 讨论

第三章 V.boronicumulans J1腈水合酶及其激活蛋白的表达与酶活性分析

1 实验材料

1.1 菌种和质粒

1.2 培养基的配制

1.3 主要试剂及来源

1.4 主要仪器设备及其来源

1.5 主要溶液配制

1.6 酶

1.7 PCR引物

1.8 其他材料

1.9 菌株培养与保藏

2 实验方法

2.1 PCR扩增

2.2 PCR产物纯化回收

2.3 制备含粘性末端的DNA片段

2.4 构建表达载体并转化至E.coli BL21

2.5 目的蛋白的诱导表达及表达条件的优化

2.6 SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况

2.7 Western blot检测目的蛋白的表达情况

2.8 腈水合酶活性分析

2.9 转化产物的LC-MS分析

2.10 转化产物提取与纯化

2.11 转化产物的核磁共振光谱分析

3 结果

3.1 PCR结果

3.2 目的片段连pMD-18T阳性克隆筛选结果

3.3 目的片段连pET-28a表达载体

3.4 各目的基因诱导表达SDS-PAGE电泳结果

3.5 目的蛋白Western blot检测结果

3.6 静息细胞转化噻虫啉结果

3.7 转化产物LC-MS分析结果

3.8 转化产物的核磁共振光谱分析结果

4 讨论

第四章 腈水合酶过表达菌株对3-氰基吡啶的酶活性分析

1 实验材料

1.1 菌种

1.2 培养基的配制

1.3 主要试剂及来源

1.4 主要仪器设备及其来源

1.5 主要溶液配制

1.6 菌株培养与保藏

2 实验方法

2.1 菌株培养

2.2 静息细胞转化3-氰基吡啶

2.3 诱导菌株细胞粗提液腈水合酶的活性分析

2.4 HPLC分析

3 实验结果

3.1 静息细胞转化3-氰基吡啶结果

3.2 诱导菌株细胞粗提液腈水合酶的活性分析结果

4 讨论

参考文献

本文的创新和不足之处

致谢

附件

附件一：在读研究生期间主要科研情况

附件二：V.boronicumulans J1菌株腈水合酶基因核酸序列

附件三：V.boronicumulans J1菌株腈水合酶活化蛋白基因核酸序列