趋磁菌AMB-1超氧化物歧化酶基因的克隆表达及不同还原剂下菌体生长和磁小体合成的研究

摘要

趋磁菌Magnetospirillum AMB-1产生的磁小体是一种晶型完美、单分散性、生物性能良好的纳米级Fe3O4型磁性微球，其粒径分布在50-100nm，磁学特性与通过化学合成的磁性微球相当。磁小体作为一种有待于开发利用的磁性纳米材料，现已在医学、生物学、电子学以及航天工业有所应用。目前，在通过培养条件优化方法来提高AMB-1生长密度及增强磁小体合成能力的研究中发现培养环境中的氧气浓度是一个重要因素：氧气浓度太高或太低会对菌体生长及磁小体的合成产生明显的抑制作用。本研究主要尝试对AMB-1的抗氧化代谢系统在菌体生长、磁小体合成中的重要作用进行初步探索研究。
　　1.AMB-1的两个超氧化物歧化酶基因(fesod和cu/znsod)的生物信息学分析
　　对趋磁菌AMB-1的两个超氧化物歧化酶Fe-SOD及Cu/Zn-SOD从初级结构到空间结构等生物信息学方面进行初步研究。结果表明：fesod基因全长597bp，编码199个氨基酸，不含有信号肽序列，在119到137氨基酸间可能存在一个跨膜结构，其蛋白三级预测结构同Thermophilic CyanobacteriumThermosynechococcus Elongatus中的Fe-SOD最为相似；cu/znsod基因全长531bp，编码177个氨基酸，可能含有信号肽序列，并且在前50个氨基酸序列可能存在2个跨膜结构，其蛋白三级预测结构同Salmonella typhimurium中的Cu/Zn-SOD最为相似。
　　2.AMB-1超氧化物歧化酶基因(fesod和cu/znsod)在大肠杆菌中的克隆表达
　　在本研究中，趋磁菌AMB-1来源的fesod和cu/znsod在大肠杆菌BL21(DE3)中进行克隆表达。通过PCR的方法从AMB-1的基因组中扩增到两个SOD基因片段，分别连接到IPTG诱导型表达载体pET-20b上，得到重组质粒pET-20b-fesod-histag和pET-20b-cu/znsod-histag，并电转化E.coil BL21(DE3)。生长曲线表明：重组菌株BL21(DE3)/(pET-20b-cu/znsod-histag)以及BL21(DE3)/(pET-20b-fesod-histag)生长速率及生长最终密度明显高于对照组BL21(DE3)/(pET-20b)。重组菌株BL21(DE3)/(pET-20b-fesod-histagl)以及BL21(DE3)/(pET-20b-cu/znsod-histag，)单位细胞中SOD活力明显高于对照组BL21(DE3)/pET-20b)。SDS-PAGE蛋白电泳分析发现：fesod得到了有效表达，蛋白分子量约为22 KDa；在BL21(DE3)/(pET-20b-cu/znsod-histag)重组菌株的诱导表达中，一个推测为宿主菌中SOD蛋白(分子量约为24 KDa)的表达水平逐渐上升，而cu/znsod没有得到表达。
　　3.通过基因工程手段提高AMB-1超氧化物歧化酶的表达水平
　　为提高趋磁菌AMB-1对氧的耐受水平，尝试通过基因工程手段增强该菌内Fe-SOD和Cu/Zn-SOD两种超氧化物歧化酶的表达水平。利用可以在革兰氏阴性菌中复制遗传的广宿主载体pBBR1-MCS-4，实验中构建了两个游离型重组载体pBBR1-P16-fesod-histag和pBBR1-P16-cu/znsod-histag。同时，利用AMB-1基因组中的rDNA作为同源整合的目标序列区段，实验中构建了两个同源重组整合型载体pET-20b-rDNA-P16-fesod-histag和pET-20b-rDNA-P16-cu/znsod-histag。在构建的载体中，氨苄青霉素抗性基因(ampr)作为主要的筛选标记，AMB-1中组成型强启动子P16和来源于pET-20b的T7转录终止子构成主要的表达元件。通过电转化，游离型载体尚未能够成功转入AMB-1中，整合型载体也未能整合至基因组的rDNA区段。
　　4.不同浓度的还原剂对AMB-1菌体生长及磁小体合成的影响
　　为探索AMB-1生长及磁小体合成的最佳环境，本研究中探索了一系列浓度梯度的不同种类的还原剂对该菌生长及产磁的影响。实验结果表明：在微好氧的条件下，培养基中加入还原型谷胱甘肽(CSH)以及连二亚硫酸钠能够有效提高该菌的生长密度；在微好氧的条件下，培养基中加入GSH以及L-半胱氨酸能够增强该菌磁小体合成的能力。因此，在微好氧的条件下，在培养基中加入适当浓度的GSH(0.25mg/ml)，能够提高菌体生长密度的同时明显增强了磁小体的合成能力。

目录

文摘

英文文摘

缩写表

第一章 前言

1.1 磁性纳米微球应用的研究现状

1.1.1 磁性纳米微球在生物分离中的应用

1.1.2 磁性纳米微球在生物酶催化中的应用

1.1.3 磁性纳米微球在生物医学中的应用

1.1.4 纳米磁性微球在免疫学中的应用

1.1.5 商业化的磁性纳米材料存在的问题

1.2 趋磁细菌及磁小体的研究现状

1.2.1 趋磁细菌及其趋磁特性

1.2.2 磁小体及磁小体的特性

1.2.3 磁小体潜在的应用价值

1.2.4 氧气浓度对磁小体合成的影响

1.3 超氧化物歧化酶的研究现状

1.3.1 生物体内氧自由基和氧自由基清除系统

1.3.2 超氧化物歧化酶的功能研究

1.3.3 趋磁菌AMB-1中的超氧化物歧化酶研究

1.4 研究意义及目标

1.5 研究内容

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 质粒和菌种

2.1.2 培养基

2.1.3 主要试剂及其来源

2.1.4 主要仪器设备及其来源

2.1.5 DNA引物合成和DNA测序服务

2.2 方法

2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.2 大肠杆菌的电转化

2.2.3 AMB-1感受态细胞的制备

2.2.4 AMB-1的电转化

2.2.5 基因操作

2.2.6 聚丙烯酰氨凝胶电泳

2.2.7 蛋白质浓度的测定

2.2.8 Ni-NTAAgarose亲和层析纯化

2.2.9 超氧化物岐化酶SOD酶活性测定

2.2.10 趋磁螺菌AMB-1超氧化物歧化酶的信息学分析

2.2.11 AMB-1超氧化物歧化酶的的克隆表达及生理功能验证

2.2.12 过表达自身超氧化物歧化酶AMB-1突变株的构建

2.2.13 不同种类的抗氧化还原剂下AMB-1生长及产磁特性研究

第三章 结果

3.1 超氧化物歧化酶的信息学分析

3.1.1 Fe-SOD(amb2511)、Cu/Zn-SOD(amb2978)基因及其序列

3.1.2 Fe-SOD、Cu/Zn-SOD启动子及转录终止子的预测分析

3.1.3 Fe-SOD、Cu/Zn-SOD氨基酸同源性分析

3.1.4 Fe-SOD、Cu/Zn-SOD蛋白质性质预测分析

3.1.5 Fe-SOD、Cu/Zn-SOD信号肽预测分析

3.1.6 Fe-SOD、Cu/Zn-SOD跨膜结构预测分析

3.1.7 Fe-SOD、Cu/Zn-SOD蛋白磷酸化位点预测分析

3.1.8 Fe-SOD、Cu/Zn-SOD蛋白亚细胞定位预测分析

3.1.9 Fe-SOD、Cu/Zn-SOD蛋白二级结构预测分析

3.1.10 Fe-SOD、Cu/Zn-SOD蛋白三级结构预测分析

3.2 AMB-1超氧化物歧化酶Fe-SOD、Cu/Zn-SOD在大肠杆菌中的表达

3.2.1 趋磁菌AMB-1基因组的提取

3.2.2 重组质粒pET-20b-fesod-histag 和pET-20b-cu/znsod-histag的构建及验证

3.2.3 Fe-SOD和Cu/Zn-SOD在大肠杆菌中的表达及对宿主菌生长的影响

3.2.4 Fe-SOD和Cu/Zn-SOD重组酶的纯化

3.2.5 Fe-SOD重组酶酶学性质分析

3.3 过表达自身超氧化物歧化酶 AMB-1突变株的构建

3.3.1 单交换整合型重组质粒pET-20b-rDNA-P16-fesod-histag及pET-20b--rDNA-P16-cu/znsod-histag的构建

3.3.2 游离重组质粒pBBR1-P16-fesod-histag及pBBR1-P16-cu/znsod-histag的构建

3.3.3 整合型过表达自身超氧化物岐化酶的AMB－1突变株构建

3.3.4 游离型过表达自身超氧化物歧化酶的AMB－1突变株构建

3.4 不同种类的抗氧化还原剂下AMB-1生长及产磁特性研究

3.4.1 AMB-1在标准培养基中通氧、微氧、厌氧培养下菌体生长及磁小体合成情况

3.4.2 微氧培养条件下不同浓度的抗氧化还原剂对AMB-1菌体生长及磁小体合成的影响

第四章 讨论

4.1 趋磁菌AMB-1超氧化物歧化酶基因的信息学分析

4.2 趋磁菌AMB-1超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的表达及生理功能研究

4.3 过表达自身超氧化物歧化酶的AMB-1突变株构建

4.4 不同种类的抗氧化还原剂对AMB-1生长及磁小体合成的影响

主要结论

参考文献

致谢