虹鳟鱼γ-INF诱导的溶酶体巯基还原酶及LIGHT(TNFSF14)的克隆、表达及生物学活性研究

摘要

干扰素-γ诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)在MHCⅡ抗原呈递过程中起着还原二硫键的关键作用。LIGHT是TNF家族第14号成员，它在诱导肿瘤细胞凋亡、T细胞的共刺激、淋巴样结构的发生与发育、树突状细胞的活化等过程中发挥着重要的作用。本文运用PCR、Real-time PCR、大肠杆菌原核表达、Westernbloting等分子生物学技术以及一些生物信息学方法，对虹鳟鱼的GILT（rGILT）和LIGHT(rLIGHT)的核苷酸序列、氨基酸序列、组织分布及重组蛋白部分生物学活性等方面进行了分析和研究。结果如下:
　　1虹鳟鱼GILT的克隆、表达以及活性研究
　　从虹鳟鱼脾脏中提取RNA继而扩增得到虹鳟鱼GILT基因(简称rGILT)。rGILT的cDNA序列长为762 bp，编码253个氨基酸，蛋白分子量约为28.23 kDa，其理论等电点约为4.94。虹鳟鱼GILT蛋白包含GILT蛋白的特征性结构序列:CXXC基序和CQHGX2ECX2NX4C。且进化分析表明rGILT与其他物种的GILT起源于同一祖先。实时定量PCR结果表明，rGILT的表达具有组织特异性，并且经过LPS刺激后，其在脾脏细胞和肾细胞中的表达量明显上调，而虹鳟鱼干扰素-γ（简称rIFN-γ）在这些细胞中的mRNA表达水平也有类似趋势。随后在BL21(DE3)中表达了带有His标签的pET28a-rGILT重组蛋白，并进行了SDS-PAGE和Western Blot鉴定。最后，将人IgG抗体作为底物，我们测定了rGILT的巯基还原酶活性。这些结果表明，rGILT能够还原二硫键，对机体的天然免疫防护有重要作用，同时也为鱼类免疫中GILT的角色提供新的研究依据。
　　2虹鳟鱼LIGHT的克隆、可溶区表达和组织定量分析
　　本文选择虹鳟鱼作为研究对象，通过RT-PCR的方法从虹鳟鱼的脾脏组织中扩增得到开放阅读框为717 bp的LIGHT基因，并对这个基因在不同物种中的同源关系进行了进化分析。通过Real-time PCR的方法对LIGHT基因在不同组织中的分布表达进行了定量分析。通过基因工程手段，构建了pETSUMO-rsLIGHT(虹鳟鱼LIGHT可溶区)重组载体，在体外获得了相应的可溶性蛋白。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 文献综述

第1章 γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)的研究进展

1．1 溶酶体简介

1．2 γ-干扰素简介

1．3 γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)

第2章 LIGHT(TNFSF14)的研究进展

2．1 LIGHT表达分布与受体分布

2．2 LIGHT生物学功能研究概况

第3章 虹鳟鱼简介及鱼类免疫系统研究进展

3．1 虹鳟鱼简介

3．2 鱼类免疫系统

第二部分 实验部分

第4章 虹鳟鱼γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)的克隆和表达分析

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 实验结果与分析

4．4 讨论

第5章 虹鳟鱼LIGHT的克隆和相关表达分析

5．1 实验材料

5．2 实验方法

5．3 实验结果与分析

5．4 讨论

总结

参考文献

附录：硕士期间发表的学术论文及研究成果

致谢