鱼藤酮通过钙信号转导抑制mTOR通路诱导神经细胞凋亡机理研究

摘要

本文运用细胞培养、[Ca2+]i荧光染色、细胞凋亡DAPI染色、Western bloting等细胞学分子生物学技术，综合研究了鱼藤酮诱发神经细胞凋亡过程中，胞内游离钙离子([Ca2+]i)变化及其对mTOR信号通路的影响。探讨了[Ca2+]i在鱼藤酮致神经细胞凋亡中的调控作用及[Ca2+]i升高机制，以及通过CaM抑制剂TFP论证了CaM在鱼藤酮上调胞内[Ca2+]i信号引发神经细胞凋亡过程中信号转导分子机制。具体结果如下: 1.鱼藤酮诱导神经细胞[Ca2+]i升高涉及mTOR通路抑制和凋亡以PC12和原代神经元为对象，采用不同鱼藤酮浓度(0、0.05、0.1、0.3、0.5、1μM)处理24 h、或用胞内钙螯合剂BAPTA/AM预处理1h，然后暴露0.5和1μM鱼藤酮4或24 h，以Fluo-3/AM为荧光探针分析细胞内钙离子([Ca2+]i)的荧光强度，One Solution分析细胞活性，DAPI染色分析细胞凋亡，并用Westernblot分析BAPTA/AM对鱼藤酮诱导神经细胞凋亡过程中mTOR信号通路影响。结果显示，鱼藤酮以浓度依赖的方式触发[Ca2+]i升高导致神经细胞凋亡，并关联着mTOR及其介导的S6K1和4E-BP1通路抑制。BAPTA/AM可以通过阻滞mTOR通路抑制，且明显削弱鱼藤酮诱导的PC12细胞和原代神经元凋亡。提示:鱼藤酮诱导神经细胞[Ca2+]i升高涉及mTOR通路抑制和凋亡。 2.鱼藤酮诱导[Ca2+]i升高机理及与抑制mTOR通路涉及神经细胞凋亡关系选用内质网IP3受体抑制剂2-APB和钙离子螯合剂EGTA来研究内质网内钙和胞外钙是否参与了鱼藤酮诱导[Ca2+]i升高。PC12细胞和原代神经元接种于6孔或96孔培养板中，在2-APB（100μM）或EGTA（100μM）预处理1h后，暴露0.5和1μM鱼藤酮处理4或24 h。分别采用One Solution分析细胞活性，以Fluo-3/AM为荧光探针分析2-APB或EGTA对[Ca2+]i的影响并结合DAPI染色观察其对鱼藤酮诱发的神经细胞凋亡的保护作用;同时利用Western Blotting检测2-APB或EGTA阻断胞内钙库释放或胞外钙来源后，对神经细胞凋亡过程mTOR信号通路的影响。结果显示，2-APB或EGTA可以明显降低鱼藤酮诱发的[Ca2+]i水平，通过逆转mTOR、S6K1和4E-BP1磷酸化抑制，能够削弱鱼藤酮诱导的PCi2细胞和原代神经元活性下降和凋亡。提示:内质网上IP3R激活，钙释放通道的打开，以及胞外钙离子的进入可能是鱼藤酮引发[Ca2+]i升高的重要机制，2-APB或EGTA对神经细胞死亡有明显保护作用。 3.鱼藤酮通过[Ca2+]i升高介导CaM活化抑制mTOR通路涉及神经细胞凋亡PC12细胞和原代神经元接种于6孔或96孔培养板中，在TFP(10μM)、BAPTA/AM（30μM）、2-APB（100μM）.或EGTA（100μM）预处理1h后，暴露0.5和1μM鱼藤酮处理4或24 h。分别采用One Solution分析细胞活性，DAPI染色分析细胞凋亡、Western Blotting检测TFP对神经细胞mTOR信号通路以及BAPTA/AM、2-APB、EGTA或TFP对caspase-3和PARP表达的影响。结果显示，TFP可以明显逆转鱼藤酮诱发的mTOR、S6K1和4E-BP1磷酸化抑制、削弱鱼藤酮诱导的PC12细胞和原代神经元活性下降和凋亡。鱼藤酮升高[Ca2+]i介导caspase依赖地神经细胞凋亡，BAPTA/AM、EGTA、2-APB或TFP阻止鱼藤酮诱导原代神经元caspase通路激活。提示:鱼藤酮通过[Ca2+]i升高介导CaM活化抑制mTOR通路涉及神经细胞凋亡。

目录

声明

摘要

引言

第一章 鱼藤酮毒性与神经细胞凋亡

1 鱼藤酮的毒性

2 神经细胞凋亡

2．1 神经细胞凋亡表现

2．2 神经细胞凋亡机制

2．3 鱼藤酮与神经细胞凋亡

3 神经细胞凋亡中的mTOR信号通路

3．1 mTOR信号通路

3．2 神经细胞凋亡中的mTOR活性

参考文献

第二章 钙离子信号转导与神经细胞凋亡

1 钙离子与信号转导

2 钙离子与mTOR通路的关系

3 钙离子与神经细胞凋亡

3．1 钙离子与线粒体通路

3．2 钙离子与内质网通路

3．3 钙离子与死亡受体通路

参考文献

第三章 鱼藤酮诱导帕金森病征及钙离子抑制剂应用

1 鱼藤酮诱导帕金森病征

2 钙离子抑制剂应用

2．1 钙抑制剂与细胞凋亡

2．2 钙离子抑制剂和帕金森病

参考文献

第四章 鱼藤酮诱导神经细胞[Ca2+]i升高涉及mTOR通路抑制和凋亡研究

摘要

1 材料与方法

1．1 主要药品与试剂

1．2 实验动物

1．3 PC12细胞培养

1．4 原代鼠皮质神经元的分离和培养

1．5 One Solution细胞活性分析

1．6 细胞形态学观察

1．7 细胞DAPI染色凋亡分析

1．8 细胞[Ca2+]i荧光强度比色和成像分析

1．9 免疫印迹(Western blot)分析

1．10 数据处理

2 结果

2．1 鱼藤酮诱导神经细胞死亡

2．2 鱼藤酮诱导神经细胞凋亡

2．3 鱼藤酮诱导神经细胞[Ca2+]i升高

2．4 BAPTA／AM螯合[Ca2+]i保护鱼藤酮诱导神经细胞凋亡

2．5 BAPTA／AM削弱鱼藤酮诱导神经细胞mTOR通路抑制

3 讨论

参考文献

第五章 鱼藤酮诱导[Ca2+]i升高机理及与抑制mTOR通路涉及神经细胞凋亡关系研究

摘要

1 材料与方法

1．1 主要药品与试剂

1．2 实验动物

1．3 PC12细胞培养

1．4 原代鼠皮质神经元的分离和培养

1．5 One Solution细胞活性分析

1．6 细胞DAPI染色凋亡分析

1．7 细胞[Ca2+]i荧光强度比色分析

1．8 免疫印迹(Western blot)分析

1．9 数据处理

2 结果

2．1 鱼藤酮诱导内质网Ca2+释放通过抑制mTOR透露导致神经细胞凋亡

2．2 鱼藤酮诱导胞外Ca2+内流通过抑制mTOR通路导致神经细胞凋亡

3 讨论

参考文献

第六章 鱼藤酮通过[Ca2+]i升高介导CaM活化抑制mTOR通路涉及神经细胞凋亡研究

摘要

1 材料与方法

1．1 主要药品与试剂

1．2 实验动物

1．3 PC12细胞培养

1．4 原代鼠皮质神经元的分离和培养

1．5 One Solution细胞活性分析

1．6 细胞DAPI染色凋亡分析

1．7 免疫印迹(Western blot)分析

1．8 数据处理

2 结果

2．1 鱼藤酮升高[Ca2+]i通过CaM介导mTOR通路抑制导致神经细胞凋亡

2．2 鱼藤酮升高[Ca2+]i介导CaM活化关联caspase依赖的神经细胞凋亡

3 讨论

参考文献

全文结论

附1 攻读硕士学位期间研究成果

致谢