烟曲霉硫氧还蛋白还原酶GliT抗侵袭性曲霉病的免疫保护作用及机制研究

摘要

随着化疗药物、糖皮质激素的广泛使用，以及实体器官和造血干细胞移植的深入开展，侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）的发病率和死亡率显著升高。IA的致病菌以烟曲霉(A.fumigatus)为主。及时有效地进行治疗对IA患者的预后至关重要，然而，现有的抗真菌药物对IA的治疗效果有限，且有较强的肾毒性和肝毒性等毒副作用，因此以烟曲霉疫苗为基础的预防接种法为防治IA开辟了新的途径。本课题组前期研究发现了一个可以与确诊IA病人的血清发生强免疫反应的烟曲霉抗原，即硫氧还蛋白还原酶GliT(TR)，有望作为IA疫苗的候选抗原。
　　研究目的：
　　探讨烟曲霉硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase，TR)对侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）的免疫保护作用;阐明TR免疫保护作用的机制。
　　研究方法：
　　C57BL/6小鼠随机分为免疫组和对照组，免疫组小鼠用重组TR免疫2次，对照组用PBS代替抗原注射。感染烟曲霉前用环磷酰胺和地塞米松对全部小鼠进行免疫抑制处理，通过气管壁穿刺法向气管内注入烟曲霉孢子悬液，建立IA疾病模型。观察免疫组与未免疫组小鼠的存活率、存活小鼠与死亡小鼠肺组织匀浆真菌培养法测定小鼠肺内真菌载量、病理切片镜下观察肺组织病理损伤情况、小鼠肺泡灌洗液细胞分类计数，并通过ELISA方法比较分析了烟曲霉感染的免疫小鼠与未免疫小鼠、存活小鼠与死亡小鼠间肺组织匀浆IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A的含量。评估TR蛋白的免疫保护作用及作用机制。
　　研究结果：
　　小鼠7天存活率:免疫组为64.7％，对照组全部死亡。肺组织匀浆烟曲霉菌落形成单位(CFU)中位数:存活小鼠为0，死亡小鼠为44(P25，P75为21，70)(P＜0.01)。组织病理学检观察:死亡小鼠肺肿胀出血、肺泡间隔增宽、大量炎症细胞聚集、组织灶状坏死，并有大量烟曲霉菌丝存在，而存活小鼠肺组织损伤程度轻，且组织间无菌丝。肺泡灌洗液涂片染色细胞计数显示:存活小鼠单个核细胞约占84.2％，中性粒细胞仅占15.8％;死亡小鼠单个核细胞占33.6％，中性粒细胞约占66.4％。细胞因子测定结果显示:存活小鼠肺匀浆中IFN-γ明显高于对照小鼠(P＜0.01)，但IL-4、IL-10、IL-17A的含量则明显低于死亡小鼠（P＜0.01或0.05）。
　　结论：
　　烟曲霉重组蛋白TR能诱导小鼠产生抵抗曲霉侵袭性感染的免疫保护力，是一个有潜力蛋白质疫苗候选抗原。通过测定肺组织中相关的细胞因子含量，提示TR蛋白的免疫保护效应与CD4+Th1细胞相关。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 烟曲霉疫苗的早期研究

1．2 烟曲霉疫苗保护作用的可能机制

1．2．1 细胞免疫

1．2．2 体液免疫

1．3 烟曲霉保护性抗原的研究进展

1．4 本研究的主要内容

第2章 烟曲霉硫氧还蛋白还原酶对侵袭性曲霉病小鼠的免疫保护作用

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物与饲养

2．1．2 菌株

2．1．3 实验仪器

2．1．4 实验试剂

2．1．5 溶液配制

2．2 实验方法

2．2．1 动物分组

2．2．2 菌液制备

2．2．3 重组TR蛋白的制备

2．2．4 免疫接种

2．2．5 烟曲霉感染

2．2．6 体重测量

2．2．7 肺泡灌洗液采集及Wright-Giemsa染色

2．2．8 真菌载量计数

2．2．9 组织病理学检查

2．2．10 统计学分析

2．3 结果

2．3．1 血清抗体效价

2．3．2 存活情况

2．3．3 肺组织真菌菌落计数

2．3．4 肺外器官真菌培养

2．3．5 肺组织病理学

2．3．6 肺泡灌洗液细胞分类计数

2．4 讨论

第3章 性曲霉病小鼠肺组织中IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A的测定

3．1 实验材料

3．1．1 实验动物与饲养

3．1．2 菌株

3．1．3 实验仪器

3．1．4 实验试剂

3．1．5 溶液配制

3．2 实验方法

3．2．1 动物分组

3．2．2 菌液制备

3．2．3 重组TR蛋白的制备

3．2．4 免疫接种

3．2．5 烟曲霉感染

3．2．6 标本采集与处理

3．2．7 肺组织蛋白含量测定

3．2．8 小鼠肺组织IFN-γ含量的测定

3．2．9 小鼠肺组织IL-4含量的测定

3．2．10 小鼠肺组织IL-10含量的测定

3．2．11 小鼠肺组织IL-17A含量的测定

3．2．12 统计学分析

3．3 结果

3．3．1 小鼠肺组织匀浆IFN-γ的含量

3．3．2 小鼠肺组织匀浆IL-4的含量

3．3．3 小鼠肺组织匀浆IL-10的含量

3．3．4 小鼠肺组织匀浆IL-17A的含量

3．4 讨论

第4章 主要结论及不足

4．1 本研究的主要结论

4．2 存在问题与后续研究打算

参考文献

主要英文缩略词表

攻读硕士学位期间发表的学术论文及参加的学术会议

致谢