哺乳动物病毒型TLRs基因的适应性进化及鲸类TLR8的功能验证研究

摘要

哺乳动物是地球上最为高等且占据主导地位的一类脊椎动物。其中绝大多数体表被有毛发，体温恒定，具有肉食、草食、杂食等多种食性。哺乳动物的生存环境多样----陆地、海洋、天空、洞穴都有其身影。由于哺乳动物类群的庞大和多样性，在长期的进化过程中，为了适应不同的生存环境，哺乳动物中某些特殊类群势必发生了较其他类群显著不同的适应性改变。先天免疫作为大多数动物抵御病原微生物入侵的系统，是较为古老的、机体抵御外界病原微生物的第一道防线。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是一个介导先天免疫的古老家族，分为病毒型和非病毒型两类。其中TLR3、TLR7、TLR8和TLR9属于病毒型TLRs。它们定位在胞内体膜上，识别病毒的核酸类物质。由于哺乳动物的生存环境和食性等的巨大差异，其面临的病毒种类也有所不同。然而，关于病毒型TLRs的进化研究一般认为其较为保守。
　　本研究选取27个哺乳动物的TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的序列进行了进化分析。PAML的位点模型、枝位点模型以及Datamonkey的SLAC、FEL、REL模型分析发现，这4个基因在哺乳动物中检测到了大量的正选择位点，其中TLR9最多。并且绝大多数位点位于胞外域的LRR功能域中。LRR功能域是直接与PAMPs结合的区域，受到了较为强烈的正选择作用。通过枝位点模型和free-ratio模型分析发现，病毒型TLRs在鲸类物种和翼手目物种受到了较强的选择压力。推测鲸类及翼手目在长期的进化过程中，由于海洋生存环境以及天空、洞穴的生存环境，使得其面临的病毒类型、数量和大多数哺乳动物存在有差异，其病毒型TLRs受到的选择压力发生了改变。在其它枝系如鲸偶蹄目、灵长目等也检测到了正选择信号，说明哺乳动物病毒型TLRs受到了普遍的正选择作用。其中TLR9检测到了最普遍的正选择信号，推测可能与其是唯一识别DNA物质的TLR有关，是与病毒长期共进化的结果。除此之外，本研究还在细胞水平上对瓶鼻海豚TLR8基因进行了功能验证。结果发现瓶鼻海豚的TLR8基因是有免疫应答功能的基因，可以被TLR8特异配体R848刺激激活，但是与家牛比较，其对R848的敏感程度不如家牛TLR8。这可能是由于鲸类为了适应海洋环境，其先天免疫基因TLR8发生了某些适应性进化。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 Toll样受体的简介

1．1．1 Toll样受体的发现

1．1．2 Toll样受体的成员

1．1．3 Toll样受体的结构特征

1．2 病毒型TLRs的概述

1．2．1 病毒型TLRs的成员

1．2．2 病毒型TLRs的配体

1．2．3 病毒型TLRs的信号转导通路

1．3 TLRs在对病毒免疫中的作用及病毒型TLRs的研究现状

1．4 哺乳动物的特征、分类以及其在进化研究中的意义

1．4．1 哺乳动物的主要特征

1．4．2 哺乳动物的起源与分类

1．4．3 哺乳动物的适应性进化研究及其意义

1．5 研究的目的与意义

第2章 哺乳动物病毒型TLRs基因选择压力分析

2．1 研究材料

2．2 研究方法

2．2．1 数据整理

2．2．2 胞膜外域序列的预测

2．2．3 选择压力分析

2．2．4 三维结构预测

2．3 结果

2．3．1 病毒型TLRs基因序列的获取情况

2．3．2 晡乳动物病毒型TLRs基因选择压力分析结果

2．3．3 鲸类病毒型TLRs基因选择压力分析结果

2．4 讨论

2．4．1 哺乳动物病毒型TLRs受到了普遍的正选择作用

2．4．2 病毒型TLRs的正选择信号集中于其胞外域部分

2．4．3 TLR9发生了最强烈、最广泛的适应性进化

第3章 鲸类TLR8基因功能验证与分析

3．1 实验材料

3．1．1 样品获取

3．1．2 实验试剂

3．1．3 实验器材

3．2 实验步骤与方法

3．2．1 瓶鼻海豚基因组DNA获取

3．2．2 家牛cDNA获取

3．2．3 表达载体的构建

3．2．4 细胞培养及转染

3．2．5 双荧光素酶报告系统检测NF-kB表达情况

3．2．6 实时荧光定量PCR检测IL-8表达情况

3．3 实验结果

3．3．1 基因组DNA，RNA质量检测

3．3．2 PCR及载体构建结果

3．3．3 TLR8的表达情况及转染效率

3．3．4 R848对TLR8下游基因NF-kB表达水平的影响

3．3．5 R848对TLR8下游基因IL-8表达水平的影响

3．4 讨论

3．4．1 瓶鼻海豚TLR8是有免疫识别和应答功能的基因

3．4．2 瓶鼻海豚与家牛TLR8免疫功能存在显著差异

总结

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢