鲸类大脑进化的分子机制：基于MCPH基因的进化分析与ASPM基因功能研究

摘要

鲸类是一类神秘的次生性海洋哺乳动物，其陆生祖先（类似有蹄类）大约在53 Mya从陆地返回海洋。比较解剖学和化石证据表明，在鲸类的进化历程中，脑容量持续增大，尤其是齿鲸起源期以及海豚超科快速辐射时期相对脑容量（用脑商Encephalization quotient，EQ来表示）出现显著增大，而须鲸类物种由于体长的异常增大导致EQ显著减小。先前的生态学研究表明，鲸类脑容量增大主要是适应水生生境中复杂的社会压力的结果，它们营群居生活，个体间进行交流、合作以及竞争等社会活动，即符合“社会脑(social brain hypothesis)”假说。然而，鲸类脑容量进化的遗传学基础尚不清楚。本研究选择头小畸形相关基因MCPH(Primary autosomal recessive microcephaly)的7个基因（MCPH1-7:MCPH1、WDR62、CDK5RAP2、CEP152、ASPM、CENP和STIL)，该基因突变将导致入的大脑容量显著缩小。通过鲸类代表性物种MCPHs的基因克隆和生物信息学分析，探讨:(1)鲸类MCPHs基因的进化模式如何？是否受正选择驱动？不同谱系所受的选择压力是否相同？(2)鲸类MCPHs基因的分子进化是否与大脑表型特征（如:EQ、绝对脑重和体重）存在相关性？(3)以集群大小(group size)作为社会复杂度的一个指标，鲸类MCPHs基因的进化与其是否存在相关性？能否从分子水平支持“社会脑”假说？(4)鲸类受正选择的MCPHs基因是否产生了适应性功能改变？
　　本研究通过PCR扩增和从数据库中下载已有的基因序列，共获得鲸类17个代表性物种（包括14个齿鲸和3个须鲸）的7个MCPHs基因的所有外元序列。通过MEGA6.0序列比对发现10个鲸类物种MCPH1基因出现移码突变和提前终止密码子，并且移码突变位置大多位于或接近功能域。此外，运用PAML4.7分析表明发生假基因化的鲸类谱系选择压力放松，但选择压力并没有完全移除，以上结果提示鲸类MCPH1基因可能为假基因。
　　MCPH2-7基因并未出现移码突变和提前终止密码子，提示为功能基因。运用PAML4.7软件包中的位点模型检测，发现5个MCPHs基因（WDR62、CDK5RAP2、CEP152、ASPM和STIL）含有选择压力的模型显著优于中性模型（P＜0.001），提示鲸类的这5个MCPHs基因受正选择。同时，通过3种最大似然法(Maximum Likelihood，ML)即M8、FEL和REL鉴定了一系列的正选择位点，其中60个正选择位点至少被两种ML方法检测到，11个正选择位点同时被3种ML方法检测到，提示这5个MCPHs基因在鲸类中普遍受到正选择作用。TreeSAAP软件对氨基酸性质分析表明，有88.33％的正选择位点产生激进氨基酸性质改变，这是正选择的又一证据。I-TASSER在线预测MCPH2-7蛋白的三维结构，发现超过50％的正选择位点位于或接近于其重要功能域，以上结果表明鲸类的5个MCPHs基因发生了适应性进化。另外，运用PAML4.7软件包中的支模型(branch model)和支位点模型(branch-site model)分析表明CDK5RAP2基因在EQ值增大的齿鲸物种以及EQ值减小的须鲸祖先支均检测到正选择，而在ASPM、 STIL和WDR62基因，正选择仅出现在EQ值增大的齿鲸谱系中。非常有趣地是，ASPM与CDK5RAP2基因的进化与EQ值显著正相关(R2CDK5RAP2=0.397，PCDK5RAP2=0.022; R2 ASPM=0.547，PASPM=0.006)，提示这两个基因在鲸类相对脑容量增大中起重要作用。这一推测在初步的功能试验中也得到证实，ASPM基因正选择位点site1684所在IQ motif与钙调蛋白CaM进行GST-pulldown和Octet蛋白互作实验表明EQ值增大的齿鲸类物种结合能力强于EQ值减小的须鲸物种。非常惊奇的是，ASPM、 CDK5RAP2和CEP152基因与集群大小(meangroup size)显著正相关或接近正相关(R2CDK5RAP2=0.213，PCDK5RAP2=0.055; R2CEP152=0.167，PCEP152=0.082;R2ASPM=0.315，P ASPM=0.022)，为“社会脑”假说提供了分子证据，提示鲸类脑容量的增大是应对复杂的社会压力的结果。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 鲸类与灵长类脑容量的显著增大

1．2 古生物学揭示鲸类脑容量增大的进化事件

1．3 脑容量增大的主要假说

1．4 头小畸形(MCPHs)基因研究进展

1．4．1 MCPHs基因的概述

1．4．2 MCPHs基因在野生动物大脑进化中的研究进展

1．5 本研究探讨的科学问题及意义

第二章 材料与方法

2．1 样本的收集和序列的获得

2．1．1 MCPHs基因的扩增

2．1．2 MCPHs基因的下载

2．2 选择压力分析

2．3 MCPHs基因的三维结构分析

2．4 MCPHs基因与鲸类表型的相关性分析

2．5 ASPM基因正选择位点的功能验证

2．5．1 前言

2．5．2 菌种与质粒

2．5．3 ASPM基因正选择位点定位到具体的IQ motif

2．5．4 RNA的提取与反转录

2．5．5 pET-28a(+)-CaM质粒构建

2．5．6 His-CaM蛋白的表达与纯化

2．5．7 鲸类pGST-4T-1-IQ质粒构建

2．5．8 GST-IQ蛋白的表达与纯化

2．5．9 CaM与IQ蛋白相互作用

第三章 研究结果

3．1 MCPHs基因序列获得情况

3．2 鲸类MCPHs基因的进化分析

3．3 MCPHs基因正选择位点在三维结构的分布

3．4 MCPHs基因进化与鲸类大脑表型的相关性分析

3．5 MCPHs基因进化与鲸类集群大小的相关性分析

3．6 ASPM基因正选择位点的功能验证

3．6．1 PCR扩增CaM片段

3．6．2 双酶切鉴定重组质粒pET-28a-CaM

3．6．3 Ni-IDA纯化CaM蛋白

3．6．4 Western blotting鉴定CaM蛋白

3．6．5 确定现生鲸类与最近祖先支不同的正选择位点

3．6．6 PCR扩增柏氏中喙鲸、白暨豚与小须鲸正选择位点所在IQ motif

3．6．7 PCR扩增瓶鼻海豚和条纹原海豚site1684所在IQ区

3．6．8 Western blotting鉴定pGEX-4T-1-IQ重组质粒

3．6．9 GST-pulldown鉴定ASPM正选择位点所在IQ蛋白与钙调蛋白CaM相互作用

3．6．10 Fortebio Octet进一步鉴定ASPM site 1684所在IQ蛋白与CaM相互作用

第四章 讨论

4．1 MCPHs基因的适应性进化普遍存在于鲸类进化谱系

4．2 鲸类MCPHs基因与大脑表型的相关性

4．3 鲸类脑容量的增大是应对复杂社会环境的结果

4．4 鲸类ASPM基因发生了适应性功能改变

第五章 小结

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢