粟酒裂殖酵母线粒体翻译起始因子Mti2和Mti3功能的研究

摘要

线粒体是普遍存在于真核生物的一种细胞器，它不仅与ATP的合成有关，而且还参与细胞物质代谢以及细胞凋亡等生理过程。线粒体疾病的产生大多数是由于线粒体功能受损引起的，因此线粒体与人类健康有着密切的关联。粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）在进化上与人类更为接近，在研究线粒体功能方面是一种优良的模式生物，因此线粒体也越来越受到研究者的青睐与关注。
　　粟酒裂殖酵母线粒体是一种半自主型细胞器，其自身基因组能够编码25个tRNAs，2个rRNA，1个RNase P RNA，核糖体蛋白(Var1)和7个线粒体呼吸链复合体亚基包括复合体Ⅲ的Cob1亚基，复合体Ⅳ的3个大亚基(Cox1，Cox2，Cox3)，复合体Ⅴ的3个亚基(Atp6，Atp8，Atp9)。粟酒裂殖酵母线粒体蛋白的翻译过程包括起始、延伸、终止，此过程需要多种蛋白因子共同参与调控。Mti2和Mti3是预测与线粒体翻译起始有关的蛋白，Mti2的发现是通过前期免疫共沉淀实验中Ppr10与Mti2有相互作用，因此，本文主要探究粟酒裂殖酵母中Mti2，Mti3的主要功能。
　　首先构建mti2，mti3基因敲除菌，发现mti2基因敲除菌在以甘油为唯一碳源的非发酵型培养基上表现出生长缺陷，而mti3基因的缺失不表现出生长缺陷，由此推测mti2基因的缺失可能导致线粒体呼吸链功能受损。其次，通过改变培养温度以及培养时间，发现△mti2菌株在稳定期后期细胞出现了一定的死亡并且△mti2菌株在37℃下生长受到更加严重的抑制，说明△mti2菌株功能受到了影响。然后，将芽殖酵母线粒体翻译起始因子IFM1回补到△mti2菌株中，发现mti2基因敲除菌在非发酵型培养基上能够正常生长，这说明IFM1蛋白与Mti2蛋白具有功能保守性。实时荧光定量PCR发现mti2基因的缺失影响了线粒体基因组编码的mRNA水平以及稳定期后期线粒体基因组的拷贝数。最后，通过BN-PAGE和Western blot实验发现mti2基因的缺失严重影响了线粒体呼吸链上各复合体及超复合体的组装。这些实验结果表明，Mti2是裂殖酵母线粒体翻译起始因子，并基于△mti2△mti3双敲菌株在非发酵型培养基上出现了更加严重的生长缺陷，因此推测Mti3蛋白很有可能协助Mti2蛋白完成线粒体蛋白的翻译起始功能，这些结果对了解线粒体的转录调控与功能有很重要的意义。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1线粒体的介绍

1．1．1线粒体起源学说

1．1．2线粒体基因组的特点

1．2线粒体翻译起始因子介绍

1．3 BN-PAGE在蛋白复合体研究中的应用

1．4栗酒裂殖酵母作为模式生物的优点

1．5本课题的研究内容与方法

1．5．1本课题的研究内容

1．5．2本课题的研究方法

1．5．3本课题的创新与后续实验

第二章粟酒裂殖酵母中Mti2，Mti3缺失后的表型研究

2．1实验材料

2．1．1菌株与质粒

2．1．2所用试剂及耗材

2．1．3培养基与试剂配制

2．1．4仪器

2．2实验方法

2．2．1引物设计

2．2．2制备大肠杆菌感受态细胞

2．2．3 mti2-hphMX6重组质粒的构建

2．2．4利用醋酸锂转化方法将重组片段导入相应菌株中

2．2．5提取栗酒裂殖酵母转化子基因组验证

2．2．6点圈的方法

2．2．7生长曲线的测定

2．2．8Δmti2／mti2-flag回补实验

2．3实验结果与分析

2．3．1 mti2-pFA6a-hphM硝6重组质粒的酶切验证

2．3．2醋酸锂转化片段的获得

2．3．3粟酒裂殖酵母Δmti2菌株的验证

2．3．4粟酒裂殖酵母Δmti2菌株的表型研究

2．3．5 yHL6381野生型菌株和Δmti2菌株生长曲线的测定

2．3．6 Δmti2／mti2-flag回补实验

2．4讨论

第三章芽殖酵母线粒体翻译起始因子IFM1能回补Δmti2菌株

3．1实验材料

3．1．1菌株

3．1．2所用试剂和仪器

3．1．3质粒

3．1．4培养基及试剂配制

3．2实验方法

3．2．1引物设计

3．2．2生物信息学分析

3．2．3芽殖酵母基因组的提取

3．2．4 pREP4X系列质粒的构建

3．2．5 pYJ19-IFM1重组质粒的构建

3．2．6重组质粒经醋酸锂转入yHL6381和Δmti2菌株中

3．2．7荧光显微镜的观察

3．3实验结果与分析

3．3．1粟酒裂殖酵母Mti2同源性分析

3．3．2 pREP4X系列质粒构建结果

3．3．3 pYJ19-IFM1质粒构建结果与分析

3．3．4 pREP4X系列回补实验点圈结果与分析

3．3．5荧光显微镜观察结果

3．4讨论

第四章Mti2，Mti3蛋白的缺失对线粒体基因组编码的mRNA水平影响的研究

4．1实验材料

4．1．1所用菌株

4．1．2所用试剂盒

4．1．3所用引物

4．2实验方法

4．2．1粟酒裂殖酵母Total RNA的提取

4．2．2 RNA的质量检测

4．2．3 cDNA模板的获得

4．2．4实时荧光定量PCR

4．3实验结果

4．3．1 RNA的质量检测结果

4．3．2 RT-PCR的检测结果

4．4讨论

第五章检测Δmti2及Δmti3菌株线粒体基因组水平

5．1实验材料

5．1．1所用菌株

5．1．2所用试剂与耗材

5．1．3培养基

5．1．4试剂配制

5．1．5仪器

5．2实验方法

5．2．1栗酒裂殖酵母基因组的提取

5．2．2实时荧光定量PCR检测线粒体基因组拷贝数

5．3实验结果与分析

5．3．1 Mti2，Mti3缺失后不同时期线粒体基因组拷贝数结果

5．4讨论

第六章BN-PAGE检测Mti2，Mti3蛋白的缺失对线粒体复合体及超复合体组装的影响

6．1实验材料

6．1．1所用菌株

6．1．2所用试剂与耗材

6．1．3仪器

6．1．4所用培养基

6．1．7 BN-PAGE电泳试剂配制

6．2．1 BN-PAGE实验原理

6．2．2粟酒裂殖酵母线粒体粗提取

6．2．3 BCA测定线粒体浓度

6．2．4线粒体样品处理方法

6．2．5 BN-PAGE凝胶考染

6．2．6 BN-PAGE和Western blot步骤

6．3结果与分析

6．3．1粟酒裂殖酵母细胞壁酶解图

6．3．1芽殖酵母与裂殖酵母考马斯亮蓝染色结果

6．3．2 BN-PAGE和Western blot检测两种去垢剂处理线粒体结果与分析

6．4讨论

全文总结

参考文献

附录

在读期间发表的论文

致谢