棉铃虫对拟除虫菊酯氧化代谢抗性的生化与分子机理

摘要

本文利用中国、印度和巴基斯坦的棉铃虫品系，明确了不同品系对拟除虫菊酯的抗性、增效剂的增效作用及3种解毒酶的活力，从生化水平上证实细胞色素P450氧化酶解毒代谢能力增强是棉铃虫对拟除虫菊酯产生抗性的主要原因。利用实时荧光定量PCR技术确定了抗性棉铃虫细胞色素P450基因的过量表达，从分子生物学的角度证实多个细胞色素P450基因的组成性过量表达与氧化酶解毒代谢增强相关。并通过代谢酶的离体药剂降解实验，直接证实了抗性棉铃虫对拟除虫菊酯具有超强的降解代谢能力，充分证实了细胞色素P450氧化酶解毒代谢能力增强是棉铃虫对拟除虫菊酯产生抗性的主要原因。氧化代谢占主导地位的抗性机理的明确，从理论上澄清了不同地区棉铃虫可以具有不同的抗性机理，亚洲棉铃虫代谢抗性主要是氧化代谢。这无论是对种植Bt抗虫棉和非抗虫棉的地区制定合理的抗性治理策略、有效使用拟除虫菊酯类杀虫剂具有重要的指导意义。在生产上可以考虑合理使用增效剂或通过改变拟除虫菊酯的分子结构使之不适于氧化酶的代谢等有效措施控制棉铃虫的危害。

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第一章文献综述

1棉铃虫的分布与为害

2棉铃虫对拟除虫菊酯的抗药性

2.1抗药性概况

2.2对拟除虫菊酯的抗性机理

3实时荧光定量PCR技术

3.1 PCR技术从定性到定量的飞跃

3.2实时荧光定量PCR技术原理

3.3荧光化学

3.4定量方法

3.5常用的定量PCR仪

4实时荧光定量PCR技术在昆虫学研究中的应用

4.1基因拷贝数的确定

4.2 mRNA表达研究

4.3等位基因诊断

第二章棉铃虫对拟除虫菊酯代谢抗性的生化机理

摘要

前言

1材料和方法

1.1供试昆虫

1.2供试药剂

1.3生物测定

1.4酶液制备

1.5细胞色素P450氧化酶活力测定

1.6谷胱甘肽-S-转移酶活力测定

1.7酯酶活力测定

1.8蛋白含量测定

1.9数据统计分析

2结果与分析

2.1棉铃虫对不同杀虫剂的抗性

2.2增效剂对拟除虫菊酯杀虫剂的增效作用

2.3棉铃虫细胞色素P450氧化酶活力测定

2.4不同品系棉铃虫的酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活力

3讨论

3.1细胞色素P450氧化酶的底物多型性与抗药性

3.2细胞色素P450氧化酶在棉铃虫对拟除虫菊酯抗性中的作用

3.3其它抗性机理在棉铃虫对拟除虫菊酯抗性中的作用

第三章棉铃虫抗性品系和敏感品系六龄幼虫中肠微粒体对溴氰菊酯的离体代谢

摘要

前言

1材料和方法

1.1供试昆虫

1.2供试药剂

1.3微粒体制备

1.4微粒体代谢酶活性的测定

1.5蛋白含量测定

1.6 14C-溴氰菊酯的离体代谢

2结果与分析

2.1棉铃虫的微粒体代谢酶活性

2.2微粒体对14C-溴氰菊酯的离体代谢

3讨论

第四章棉铃虫抗性品系和敏感品系细胞色素P450基因mRNA表达水平的比较

摘要

前言

1材料与方法

1.1供试材料

1.2总RNA提取

1.3 cDNA第一链合成

1.4引物设计

1.5实时荧光定量PCR反应

1.6实时荧光定量PCR反应效率的确定

1.7细胞色素P450基因mRNA表达量的比较

2结果与分析

2.1 PCR产物融解曲线及荧光定量PCR扩增效率一致性分析

2.2基因相对表达量的比较

3讨论

3.1昆虫细胞色素P450研究技术路线的变迁

3.2单个P450基因的组成型过量表达与昆虫抗药性

3.3多个P450基因的组成型过量表达与昆虫抗药性

3.4昆虫P450基因的离体表达研究

全文总结与展望

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文

致谢