多花黑麦草遗传连锁图的构建及抗灰叶斑病基因的分子标记

摘要

多花黑麦草（Lolium multiflorum Lam.）为黑麦草属中最具利用价值的牧草之一，也是我国南方及其它冷凉地区栽培利用面积最广的冷季型牧草。病害是影响多花黑麦草饲草产量和品质的重要因素，多花黑麦草灰叶斑病是由病原真菌Pyricularia sp.引起的一种严重病害。遗传连锁图的构建及基于基因组DNA分子标记的开发将有助于多花黑麦草的遗传及育种研究。本研究以多花黑麦草为材料，利用简并引物PCR扩增法进行多花黑麦草抗病基因类似物（RGA）的克隆并根据获得的RGA序列设计STS引物；以多花黑麦草细胞质雄性不育分离群体（CMS群体）为材料，以SSR、AFLP、EST-CAPS和RGA-CAPS等分子标记构建多花黑麦草遗传连锁图；以多花黑麦草灰叶斑病抗病植株和感病植株杂交构建F1抗、感病分离群体，分别采用RGA-CAPS、EST-CAPS以及AFLP等分子标记方法进行抗病基因的分子标记和分析，主要结果如下：
　　 1.多花黑麦草RGA的克隆
　　 利用简并引物和巢式PCR扩增克隆法从多花黑麦草基因组中获得24000个300-500bp的DNA片段，采用单通道法对所得DNA序列进行测序，对所得序列进行公共数据库的搜索。结果表明，9344个克隆的DNA序列同已知的抗病基因或从其它植物中获得的RGA序列同源性较高，根据所得克隆的核苷酸序列的相似性，通过聚类分析将其分为185个簇，每簇中选取一个具代表性克隆作为多花黑麦草的抗病基因类似物，对185个抗病基因类似物序列进行开放阅读框的检查，舍弃无效序列，最后对115个被选择的克隆序列进行STS引物设计，成功地设计RGA-STS引物113对。
　　 2.多花黑麦草遗传连锁图的构建
　　 利用多花黑麦草假测交细胞质雄性不育（CMS）分离群体（124个个体），以来自父本和母本的分离位点采用SSR、AFLP、EST-CAPS和PGA-CAPS等标记方法进行多态性的选择和并对父、母本分别构建遗传连锁图。母本连锁图包含362个标记位点，分别包含SSR标记240个、AFLP标记84个、EST-CAPS标记24个和RGA-CAPS标记14个，整个连锁图由LG1-LG7共7个连锁群组成，覆盖全长776.4cM，7个连锁群中最长的为LG3，135cM，最短的为LG5，85.8cM。相邻标记之间的平均距离为2.14cM。以来自父本的分离位点进行作图所得的LG1-LG7共7个连锁群，包含376个标记，其中SSR标记252个、AFLP标记82个、EST-CAPS标记29个和RGA-CAPS标记13个，连锁图全长710.0cM，7个连锁群中最长的为LG6，117.3cM，最短的为LG7，为80.5 cM，相邻标记之间的平均距离为1.89cM。同已报道的多年生黑麦草遗传连锁图相比，本研究中所构建的遗传连锁图具有标记密度高、标记分布均匀和连锁图长度中等等特点。
　　 3.黑麦草RGA在基因组中的分布
　　 应用由RGA序列设计的113对RGA-STS引物进行CMS群体中各个体基因组DNA的PCR扩增，扩增产物分别以识别4到6对碱基的限制性内切酶MseⅠ、AluⅠ、HpyCH4Ⅳ、ScrFⅠ、Sau96Ⅰ、Hpy188Ⅲ、DdeⅠ、N1aⅣ、HpyCH4Ⅲ、Fnu4HⅠ、Hpy188Ⅰ、AfaⅠ、MspⅠ、HaeⅢ、HhaⅠ、MboⅠ、HindⅢ、和HinfⅠ共18种进行酶切，酶切产物经2.0％琼脂糖凝胶电脉、显像和多态性检测，共检测到25对引物及相应的限制性内切酶酶切后产生多态性。所检测到的多态性位点经遗传作图，23个标记被标于多花黑麦草遗传连锁图中。结果表明多花黑麦草RGA分布于整个基因组中，但局部有RGA的聚集，其中标记RG124E11-2、RG001E01-2和RG088C11-1聚集于LG2，之间的遗传距离为8.5 cM，标记RG192G09-2、RG073A04-3和RG119F12-1聚集于LG7，之间的遗传距离为10.2 cM，标记RG021F04-2和RG227D4-1聚集于LG3，标记间距离仅为2.0cM。RGA-CAPS标记聚集的位点可能存在多花黑麦草抗病基因。
　　 4.多花黑麦草抗灰叶斑病的分子标记
　　 以多花黑麦草灰叶斑病抗病个体（Sachiaoba）和敏感个体（Minamiaoba）杂交构建F1分离群体，F1群体的致病菌接鉴定结果显示多花黑麦草抗灰叶斑病由单个主效基因（LmPi1）控制。采用分群分离分析（BSA）法进行多花黑麦草抗灰叶斑病的AFLP和EST-CAPS以及RGA-CAPS标记筛选，筛选到27个标记同多花黑麦草抗灰斑病基因LmPi1紧密连锁，其中AFLP标记25个、EST-CAPS标记1个和RGA-CAPS标记1个。经连锁分析，结果表明，27个标记构成一个紧密连锁的连锁群，标记间最大遗传距离19.6 cM。其中12个标记包括1个EST-CAPS标记和11个聚集于相同的位点，经QTL分析，该连锁区间支持1-LOD，进一步证实本研究中多花黑麦草抗灰叶斑病由单基因所控制。EST-CAPS标记p56的限制性酶切片段同多花黑麦草LmPi1位点的抗病等位基因一致。参考对照群体的遗传连锁图，抗病基因LmPi1位于多花黑麦草的第五连锁群（LG5）。标记p56试用于多花黑麦草抗灰叶斑病抗病和感病品种的基因型分析结果表明，标记p56对于感病种质中引入抗病基因LmPi1以提高其抗病性具有重要作用。
　　 多花黑麦草抗病基因类似物的克隆以及遗传连锁图的构建将为多花黑麦草抗病基因的分子标记、抗病基因的图位克隆以及抗病育种提供了方便。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 多花黑麦草及其在畜牧业发展中的作用

2 多花黑麦草灰叶斑病及其研究进展...

3 植物抗病的分子遗传学

3.1 Gene-gene假说

3.2 病原体的致病基因

3.3 植物的抗病基因

3.4 植物抗病基因的功能

4 R基因抗病机制

4.1 与病原菌非亲和因子有关的抗病机制(avr/R模式)

4.2 与病原菌亲和因子有关的抗病机制(VIR/R模式)

5 植物抗病基因标记及DNA分子标记在植物抗病性研究中的应用

5.1 植物抗病基因标记及抗病性筛选方法的发展概况

5.2 分子标记主要类型概述

5.3 分子标记在植物抗病研究中的应用

5.4 分子标记技术存在的问题和应用展望

6 抗病基因的克隆方法

6.1 图谱克隆法

6.2 转座子标签法

6.3 R基因的其他克隆方法

7 抗病基因类似物(RGA)及其在抗病基因研究中的应用

7.1 抗病基因结构特点

7.2 抗病基因类似物的克隆及其应用研究

7.3 RGA与抗病基因的关系及RGA应用展望

8 本试验研究目的及拟解决的关键问题

参考文献

第二章 多花黑麦草RGA克隆及其特性研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 DNA抽提

1.3 引物设计和基因组DNA的PCR扩增

1.4 克隆和测序

1.5 序列分析

1.6 抗病基因类似物的STS引物设计和引物的扩增验证

2 结果与分析

2.1 克隆序列分析及引物设计

2.2 多花黑麦草RGA的STS引物设计及RGA的PCR扩增

3 讨论

4 结论

参考文献

第三章 基于SSR、AFLP等标记的多花黑麦草遗传连锁图的构建

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 基因组DNA提取

1.3 SSR分析

1.4 AFLP分析

1.5 EST-CAPS分析

1.6 RGA-CAPS分析

1.7 数据统计和连锁分析

2 结果与分析

2.1 SSR引物筛选与多态性分析

2.2 AFLP多态性的检测

2.3 EST-CAPS标记分析

2.4 RGA-CAPS标记分析

2.5 高密度连锁图的构建

3 讨论

3.1 SSR标记与连锁图构建

3.2 AFLP标记与连锁图的构建

3.3 RGA及RGA-CAPS标记效率

3.4 遗传连锁图的图距

4 结论

参考文献

第四章 多花黑麦草抗灰叶斑病基因的分子标记

1 材料与方法

1.1 多花黑麦草灰叶斑病致病菌的分离及培养

1.2 试验材料及抗、感病亲本选择

1.3 F1接种鉴定和分离群体选择

1.4 多花黑麦草抗灰叶斑病基因的RGA-CAPS标记筛选

1.5 多花黑麦草抗叶斑病基因的EST-CAPS标记筛选

1.6 多花黑麦草抗叶斑病基因的AFLP标记筛选

1.7 基因型分析和连锁图构建

1.8 抗病基因分子标记在抗病性选择中的验证

2 结果与分析

2.1 F1群体抗、感病性个体鉴定和F1分离群体的选择

2.2 多花黑麦草抗叶斑病基因的RGA-CAPS标记筛选

2.3 引物RG036G04-1扩增片段序列分析

2.4 多花黑麦草抗叶斑病基因的EST-CAPS标记筛选

2.5 多花黑麦革抗灰叶斑病基因AFLP标记的筛选和区间连钞圈构建

2.6 EST-CAPS标记p56在抗病基因识别中应用

3 讨论

4 结论

参考文献

第五章 总结

1 论文研究总结论

1.1 多花黑麦草RGA的克隆及其特性研究

1.2 多花黑麦草遗传连锁图的构建

1.3 多花黑麦草抗灰叶斑病基因的分子标记

2 研究创新点及展望

附录一：缩略词

附录二：RGA引物序列及FCR扩增退火温度

附录三：攻读博士期间发表的论文

附录四：致谢