嗜水气单胞菌生物被膜形成和估算方法

摘要

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)是多种动物的重要病原菌，并可引起人的胃肠炎、败血症等疾病，对该菌的研究受到广泛关注。Ah可形成生物被膜(biofilm，BF)，被膜菌具有不同于浮游菌的各种特性。本试验建立了BF估算方法，优化Ah BF的产生条件，并比较了口服Ah BF疫苗及口服全菌灭活疫苗免疫的效果。 1 根据O’Toole和Kolter建立的方法改进，过夜培养的Ah J-1平板计数，计数后用PBS稀释成16个稀释度。从每个稀释度取200 μL用1％(w／v)结晶紫染色20 min，离心洗涤3次，自然晾干，90％乙醇萃取结晶紫，测A<,590>如吸光值。建立细菌数对数与吸光值之间的线性关系。同样方法染色生物被膜，测A<,590>吸光值。根据标准曲线计算相应的细菌数，该细菌数可视为形成生物被膜的细菌数量，建立用生物被膜含细菌数量估算生物被膜的方法。同时用显微镜和扫描电镜进行Ah BF的定性分析，结果显示所建立的结晶紫染色方法可估算生物被膜的量。 2 在自然环境中，细菌主要的生存方式是在载体上以生物被膜形式存在。本试验从培养基和介质两方面研究了生物被膜产生的影响条件。结果显示MM9和Mg+LB能促进嗜水气单胞菌生物被膜的形成，并且Mg<'2+>只在一定浓度范围内促进BF的形成，而LB+MOPS和3LB+Glucose两培养基则抑制其形成；表面粗糙的甲壳素较聚苯乙烯更有利于BF的形成。 3 将热灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)生物被膜(biofilm，BF)菌苗以佐剂形式加入Ah J-1的浮游细菌制备BF菌苗。按兽用生物制品制造规程制备口服Ah灭活疫苗，进行小鼠免疫。试验分为口服BF、口服全菌灭活、注射全菌灭活和空白对照四组， 16只／组。口服BF和口服全菌灭活疫苗组分别按10<'8>和10<'9>CFU／(100g·d<'-1>)喂养，连续投喂15天；注射组按0.5 mL／只(10<'7>CFU／只)剂量腹腔注射，15天后加强免疫。ELISA测定抗体效价，口服BF疫苗组效价高于口服全菌灭活疫苗组，低于注射组； 60天后以50 LD<,50>的量攻毒，口服BF疫苗，口服全菌疫苗，注射疫苗三组的相对保护率(RPS)分别为56.25％，43.75％，81.25％。结果表明口服BF疫苗较口服全菌疫苗更能有效刺激机体的免疫系统，对小鼠有一定保护力。

目录

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文献综述 第一章生物被膜的研究进展

文献综述 第二章嗜水气单胞菌的致病性和免疫学研究

研究部分 第一章嗜水气单胞菌生物被膜估算方法的建立

研究部分 第二章嗜水气单胞菌产生物被膜条件优化

研究部分 第三章嗜水气单胞菌生物被膜疫苗的小鼠免疫试验

全文总结

致谢