棉铃虫对转Bt基因棉抗性的分子检测方法研究

摘要

棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)是广泛分布于世界各大洲的重要农业害虫，上个世纪以来，棉铃虫对大多数的化学杀虫剂产生抗药性，使对其的防治愈加困难。Bt杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins，ICPs)因其具有对靶标昆虫的高度特异性和对人畜无害的安全性的优点，被人们应用于防治棉铃虫.但随着转Bt基因棉种植面积的不断扩大，转入的Bt毒蛋白在棉花的整个生长期内持续表达，使得棉铃虫在生长期间不断地受到转Bt基因棉的高选择压，存在着棉铃虫对转Bt基因棉产生抗性的风险，一旦棉铃虫对转Bt基因棉产生大范围或较大的抗性，那将是我国甚至世界的棉花生产毁灭性打击，因此，对棉铃虫对转Bt基因棉抗性的检测监测势在必行。检测田间棉铃虫对转Bt基因棉的抗性，可以对棉铃虫的田间种群的抗性发展作评估，对棉铃虫对Bt棉的抗性提.供早期预警.棉铃虫对Bt棉的抗性基因频率的检测结果，将能直接指导棉花的种植，本研究的分子检测技术也可以为其他农业害虫的田间检测提供借鉴。 传统的生物测定方法早已应用于监测害虫对Bt基因棉的抗性，但是传统的生物测定方法有其制约性，如：无法区分杂合子(sr)和敏感纯合子(ss)、采样量大、需饲养昆虫、费时、费力、灵敏度不够高等.以DNA为基础的抗性检测方法能直接检测到杂合子的抗性等位基因(r)，可明显提高抗性检测的灵敏度和效率.基于DNA分子技术的检测技术与传统的需要活虫的生物测定技术相比，拥有很多的优点，如：(1)不管是显性特征还是隐性特征，DNA分子检测技术都可以区分个体是杂合子(sr)还是敏感纯合子(ss)；(2)DNA分子检测技术直接检测基因的不同，而不是依赖于观察表型的不同；(3)DNA分子检测技术在害虫的各个生长发育期都可以应用，甚至是死虫也可以应用；(4)在抗性纯合子数量稀少的情况下，DNA分子检测技术比传统的检测方法更有效、更灵敏。 本论文通过对比分析了对转Bt基因棉抗性的棉铃虫钙粘素mRNA序列(AY714874)和敏感mRNA序列(AY351904)，以及抗性棉铃虫钙粘素基因组DNA序列(AY714875)和敏感棉铃虫钙粘素基因组DNA序列(AY714876).选择保守的外显子序列区域，设计了5套引物用于检测抗性基因，并进行筛选.利用设计并筛选过的2套引物检测田间棉铃虫因钙粘素突变引起的对转Bt基因棉的抗性.结果表明，所设计的五套引物均能百分百地在棉铃虫室内品系DNA中扩增出清晰的特异性目标条带，但第二套引物的抗性条带和敏感条带，不易区分，不适合做田间检测；第一套引物和第四套引物虽然在棉铃虫室内品系DNA中的扩出率为100％，但是在扩增田间棉铃虫DNA时，有一部分田间棉铃虫DNA能扩增出条带，不适合做田间检测；第三套引物和第五套引物在棉铃虫室内品系DNA中以及田间棉铃虫DNA中的扩出率均为100％，适合于做田间检测.应用第三套引物和第五套引物对采集自河北邱县转Bt基因棉区的1585头棉铃虫进行检测，未发现与室内棉铃虫抗性一致的因钙粘素突变引起的对转Bt基因棉产生抗性的突变类型，

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文摘

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论文说明：名词缩写

声明

第一章文献综述

1.1棉铃虫及其抗药性

1.1.1棉铃虫简介

1.1.2棉铃虫的抗药性

1.2苏云金芽孢杆菌

1.2.1苏云金芽孢杆菌简介

1.2.2苏云金芽孢杆菌的杀虫成分

1.2.3 δ-内毒素的杀虫机理

1.2.4 δ-内毒素的受体

1.3转Bt基因作物的研究与应用

1.3.1转Bt基因作物的研究

1.3.2转Bt基因作物的应用

1.3.3转Bt基因作物的效益与风险

1.3.4害虫对转Bt基因作物的抗性研究

1.4害虫对转Bt基因作物抗性的检测方法

1.4.1传统的生物测定方法

1.4.2分子检测方法

1.5本研究的立题依据与研究目的

第二章材料和方法

2.1试验材料

2.1.1供试室内棉铃虫品系

2.1.2田间棉铃虫的采集

2.1.3供试棉花品种

2.1.4供试试剂

2.1.5供试仪器

2.2试验方法

2.2.1棉铃虫DNA的提取

2.2.2钙粘素基因序列分析

2.2.3引物设计与筛选

2.2.4田间棉铃虫对转Bt基因棉抗性检测

第三章结果和分析

3.1棉铃虫钙粘素基因序列分析

3.2 DNA质量分析

3.3引物设计与筛选

3.4田间棉铃虫对转Bt基因棉抗性检测

第四章讨论

4.1高剂量/庇护所策略

4.2棉铃虫田间种群对Bt的抗性

4.2.1生物测定

4.2.2分子检测

全文主要结论

参考文献

致谢

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