H9N2亚型禽流感病毒抗原变异及感染哺乳动物分子机制的研究

摘要

H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛流行，不仅给养禽业造成了巨大的经济损失，而且对人类健康造成威胁。我国是在1994年从广东省的一个鸡场中分离到第一株H9N2亚型禽流感病毒，此后，该亚型禽流感病毒迅速向临近省份蔓延。自1998年以后，为了有效控制该亚型禽流感，利用一株早期分离株CK/SD/6/96制备灭活疫苗并在我国的一些省份进行了应用。然而，该亚型病毒的流行并未得到有效控制，甚至在免疫鸡群中仍然有病毒感染发生，而且在几个省份的猪场分离到了H9N2亚型流感病毒。我们对1996～2002年中国大陆所分离的H9N2亚型禽流感病毒进行抗原性分析和小鼠感染试验表明，许多毒株发生了抗原变异；部分晚期分离株已获得了感染哺乳动物的能力。我们从这些毒株中筛选出代表毒株，利用反向遗传技术研究以下两个问题：1)阐明H9N2亚型禽流感病毒抗原变异的分子机制；2)研究H9N2亚型禽流感病毒跨越宿主屏障感染哺乳动物-BALB/c小鼠的分子基础。 禽流感病毒由于免疫压力及病毒自身的结构，决定了流感病毒会经常发生变异，引起免疫失败和新的流行，流感病毒的两个表面蛋白HA和NA是引起机体产生中和抗体的主要抗原，HA和NA基因的突变常常引起毒株的抗原变异(Antigenic Drift)。李呈军博士对1996-2002年中国大陆分离的27株H9N2禽流感病毒进行抗原性分析表明，我国的H9N2禽流感病毒抗原性差异明显，许多毒株发生了抗原变异。我们从这27株病毒中筛选出两株抗原性变异明显的毒株CK/SD/6/96和CK/GX/10/99，利用反向遗传技术研究引起这两株病毒发生抗原变异的分子基础。构建两株病毒的两个表面基因HA和NA的双向表达质粒，同PR/8的6个内部基因表达质粒及4个蛋白表达质粒，构成“12质粒系统”救获重组病毒，HI试验表明救获的重组病毒保持了和野生毒株完全相同的抗原特性。 为确定HA基因哪一部位的氨基酸不同导致了两株病毒的抗原性差异，利用限制性内切酶将CK/SD/6/96和CK/GX/10/99的HA基因切割为3段，相互替换这些酶切片段，构建了两株病毒HA基因的嵌合质粒，救获嵌合病毒，发现引起CK/GX/10/99病毒发生抗原变异的氨基酸位于HA1的137-328氨基酸之间，在这一区域两株病毒间共有10个氨基酸的差异，利用PCR定点突变策略，逐一突变替换这些差异氨基酸，救获点突变病毒，HI试验表明HA198和200位氨基酸的替换可以导致两株病毒抗原灶发生明显改变，而其它位点的替换均不改变两株病毒的抗原性。进一步分析发现198、200位氨基酸是HA蛋白B抗原区重要的氨基酸之一，同时198位点也是HA受体结合区最重要的位点之一，CK/GX/10/99病毒198、200位氨基酸的变异可能改变B抗原区的构象，影响了病毒与抗体的结合，同样也影响了病毒受体结合特性，改变了病毒对宿主细胞的识别和吸附。分析GeneBank中可以利用的H9N2病毒的HA序列发现，198、200位氨基酸的确存在多种突变形式，是变异最为活跃的位点，因此我们的研究证明，仅仅HA基因198、200氨基酸的变异就可改变病毒CK/GX/10/99的抗原特性。 利用一系列抗H9N2的单抗来分析H9N2亚型禽流感病毒的抗原性，发现CK/SD/6/96和CKJGX/10/99与C/B3单抗的反应性差异极为显著，前者可以与单抗很好地反应，而后者与单抗则完全不反应，通过反向遗传技术和点突变策略研究发现，HA145位氨基酸的差异就完全改变了两株病毒与单抗的反应特性。进一步研究证明CK/GX/10/99病毒的145位氨基酸存在一糖基化位点，而CK/SD/6/96在此位置则缺失该糖基化。分析HA结构表明该糖链恰好位于HA蛋白的A抗原区，该糖链的出现改变了A抗原区的构象，掩盖了此抗原区，因而阻遏了单抗与病毒的结合。分析所分离的H9N2亚型禽流感病毒及GeneBank中可利用的HA序列，发现有一小部分毒株在该位点发生突变新增一糖基化位点，说明这部分毒株正在发生变异，随着这类病毒的进化有可能发生抗原变异，而引起新的流感流行。 流感病毒一般都具有严格的宿主特异性，能够在其天然宿主上很好的复制和传播，而在其它种属的宿主体内则受到限制或根本不能复制，然而这一认识被“97香港禽流感感染人事件”所打破，向世人证实了禽流感病毒可以不经过任何的适应就可以直接感染人类。H9N2亚型禽流感病毒属于低致病性禽流感病毒，通常仅引起家禽的轻微症状但不感染哺乳动物。我们对中国大陆所分离的H9N2禽流感病毒进行小鼠感染试验，表明一部分毒株已经具有感染小鼠并引起小鼠发病的能力。我们从中选出两株代表株，CK/SD/6/96和CK/GD/5/97，前者不能感染小鼠，而后者可在小鼠肺脏复制，病毒滴度达5.17Log10EID50/ml，并引起小鼠发病和体重下降。 为确定哪个基因发生了变异使CK/GD/5/97病毒获得了对小鼠的感染能力，利用反向遗传技术，构建两株病毒8个基因片段的感染性克隆，救获了两株病毒的重组亲本毒及一系列的单基因替换病毒，小鼠感染试验结果表明，用CK/GD/5/97的PB2基因替换CK/SD/6/96的PB2基因，救获的重组病毒R-SD/GDPB2，使原来对小鼠无感染性的病毒在小鼠肺脏的病毒滴度变为2.57 Lo910EID50/ml；而用CK/SD/6/96的PB2基因替换CK/GD/5/97的PB2基因所救获的单基因替换病毒R-GD/SDPB2，使病毒在小鼠肺脏的滴度由5.17Lo910EID50/ml降低至1.39Lo910EID50/ml，降低了103.78倍，由此可见，PB2基因的差异导致了病毒CK/SD/6/96和CK/GD/5/97对小鼠感染性的差异。 两株病毒的PB2基因共有11个氨基酸差异，为了进一步确定哪一个或哪几个氨基酸的突变导致两株病毒对小鼠感染性的改变，构建了PB2基因的嵌合质粒，救获嵌合病毒并感染小鼠，结果表明，PB2基因后半段的差异决定了两株病毒对小鼠的感染性。再对PB2基因后半段的5个差异氨基酸逐一替换。救获点突变病毒并进行小鼠感染试验，病毒滴定结果表明，病毒CK/SD/6/96 PB2基因的448位氨基酸由D突变为N后，使病毒的感染性大大增强，由原来的肺脏分离不到病毒改变为病毒滴度达2.61Lo910EID50/ml；反之，将CK/GD/5/97的PB2基因448位氨基酸由N替换为D后，使病毒对小鼠的感染性明显降低，肺脏病毒滴度由野生毒株的5.17 Lo910EID50/ml降为2.41Lo910EID50/ml(降低了约102.76倍)，因而，可以得出结论PB2基因448位氨基酸是决定病毒CK/SD/6/96和CK/GD/5/97对小鼠感染性差异的关键位点。 总之，本文选取了1996-2002年我国H9N2亚型禽流感病毒分离株中的代表毒株，应用反向遗传技术，首次在分子水平阐明了H9N2禽流感病毒抗原变异的分子机制，证明了HA基因198、200氨基酸的变异是H9N2亚型禽流感病毒抗原性的关键位点，另外HA基因145位氨基酸的糖基化也能导致H9N2禽流感病毒的抗原变异，在今后禽流感疫情的监测和控制中，应该高度重视这几个位点的变异。我们还利用反向遗传技术首次揭示了H9N2亚型禽流感病毒跨越宿主屏障感染哺乳动物的分子基础，证明了PB2基因448位氨基酸的突变是决定H9N2亚型禽流感病毒能够感染哺乳动物模型- BALB/c小鼠的关键因素。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

1引言

2流感的流行与现状

2.1历史上流感的爆发与流行

2.2禽流感的流行现状

3禽流感的抗原变异

3.1抗原变异相关基因的结构与功能

3.2 HA抗原变异的分子基础

3.3 NA抗原性变异的分子生物学基础

4流感病毒致病性的分子基础

4.1流感病毒各蛋白与致病性的关系

4.2流感病毒宿主特异性的分子基础

5 A型流感病毒的反向遗传技术

5.1流感病毒反向遗传技术的发展过程

5.2流感病毒反向遗传技术的应用

参考文献

实验部分 第二章 H9N2亚型禽流感病毒抗原变异分子机制的研究

1材料和方法

1.1病毒

1.2感染鸡血清

1.3主要试剂和仪器

1.4质粒载体和转染质粒

1.5引物

1.6病毒的增殖

1.7病毒RNA的提取和反转录

1.8反转录

1.9 HA和NA基因的PCR扩增

1.10PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定

1.11PCR产物的回收和纯化

1.12HA和NA重组质粒的克隆

1.13重组病毒的救获及鉴定

1.14嵌合质粒的构建与嵌合病毒的救获

1.15嵌合病毒的抗原性分析

1.16点突变质粒的构建

1.17点突变病毒的救获

1.18点突变病毒的抗原性分析

2结果

2.1抗原变异株的筛选

2.2重组质粒的克隆鉴定结果

2.3病毒救获及其鉴定结果

2.4救获重组病毒的抗原性分析结果

2.5嵌合病毒的救获及抗原性分析

2.6点突变病毒的救获及抗原性分析

3讨论

参考文献

实验部分 第三章 HA蛋白糖基化对H9N2亚型禽流感病毒抗原性的影响

1材料和方法

1.1病毒和单抗

1.2主要试剂和仪器

1.3引物

1.4重组质粒的构建

1.5病毒的救获及鉴定

1.6病毒TCID50的测定

1.7病毒中和试验

1.8重组病毒的浓缩

1.9重组病毒的SDS-PAGE电泳

1.10重组病毒及点突变病毒的Western-Blotting

1.11间接免疫荧光试验

2结果

2.1 H9N2亚型禽流感病毒与H9单抗的反应性结果

2.2 CK/SD/6/96和CK/GX/10/99病毒HA和NA基因双向表达质粒的构建及重组病毒的救获

2.3 SDHA和GXHA嵌合质粒的构建与嵌合病毒的救获

2.4点突变质粒的构建与点突变病毒救获

2.5重组病毒与145位氨基酸点突变病毒的中和试验

2.6重组病毒的间接免疫荧光试验

2.7重组病毒的蛋白电泳迁移率试验

3讨论

参考文献

实验部分 第四章 H9N2亚型禽流感病毒感染哺乳动物的分子基础

1材料和方法

1.1病毒

1.2实验动物

1.3试剂和仪器

1.4引物

1.5病毒RNA提取、反转录与PCR

1.6各基因感染性克隆的构建

1.7病毒的救获

1.8救获病毒的鉴定

1.9救获病毒的EID50测定

1.10病毒对BALB/c小鼠的感染性试验

1.11嵌合质粒的构建

1.12嵌合病毒的救获

1.13嵌合病毒的小鼠感染试验

1.14 PB2基因点突变质粒的构建

1.15 PB2点突变病毒的救获

1.16 PB2点突变病毒的小鼠感染试验

1.17病毒感染后小鼠各脏器的病理变化

2结果

2.1毒株的筛选

2.2重组双向表达质粒的构建与鉴定

2.3病毒救获与鉴定结果

2.4救获病毒EID50的测定结果

2.5野生病毒和救获重组病毒对BALB/c小鼠的感染性试验

2.6嵌合病毒的救获及其小鼠感染试验

2.7点突变病毒的救获及其小鼠感染试验

2.8野生病毒、亲本重组毒、单基因替换病毒对小鼠致病性的比较

2.9嵌合病毒和点突变病毒对小鼠致病性比较

2.10野生毒和救获病毒感染小鼠后病理变化

3讨论

参考文献

全文总结

论文创新点

附 录 本研究中所操作的3株H9N2禽流感病毒基因序列

致 谢

简 历