不结球白菜抗逆相关转录因子的克隆及耐热耐寒相关蛋白的功能鉴定

摘要

干旱、盐害、极端温度、化学毒害和氧化胁迫等非生物胁迫严重影响农业生产，并导致环境退化。植物在生长发育过程中，需要对各种逆境和发育信号作出反应，这就要求对各种功能基因的表达进行精确调控。植物在感受环境胁迫信号后，会激活相应的信号传导途径，诱导大量胁迫应答基因表达，产生相应的胁迫应答反应。根据转录因子结构以及DNA结合活性等特点，将其分成若干个家族，如NAC、Myb、HSF、bZIP等，这些转录因子在胁迫响应过程中发挥着重要的作用。 本研究利用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术从不结球白菜cDNA文库中克隆到1个新的编码NAC类转录因子的全长cDNA序列，命名为BrNAC。BrNAC基因的开放阅读框(ORF)由837bp组成，编码1个由278个氨基酸组成的NAC类转录因子。推导的氨基酸序列与油菜NAC5-8有97％的同源性，与油菜NAC5-7，NAC3同源性分别为92％和86％，与拟南芥ATAF2的同源性达89％。二级结构分析表明BrNAC具有许多其它NAC家族的共同特性。构建的同源进化树表明，BrNAC在进化关系上与AFAF2亚族转录因子最近。使用实时荧光定量PCR对BrNAC基因在不同组织中以及不同逆境胁迫下相对的转录水平进行了定量分析，结果表明，BrNAC基因的表达在茎、叶中最高，并且受冷和机械损伤和高盐的诱导，而与NAA和ABA的关系不大。 利用基于PCR的两步PTDS方法(PCR-based two-step DNA synthesis，PTDS)技术成功的合成了来源于白杨SP1基因和昆虫的抗冻肽ThpI基因。PTDS基因合成方法，是一个较为简单，高效，高保真度，低成本的基于两步PCR方法合成长DNA序列方法.同以前的合成方法比较，该PTDS还具有时间短，通常是6到7天，该方法还比较容易获得不同种类，不同长度，甚至大于6kb的DNA片段，适合高GC比，高度重复序列，复杂二级结构的DNA合成。因而，PTDS方法提供了一个能够合成不同种类、具有复杂结构的长片段基因的可行的技术。 为了进一步分析SP1基因扣ThpI基因的功能，本研究构建了农杆菌-植物双元表达载体，通过蘸花法转化拟南芥，获得转SP1基因和ThpI基因的拟南芥植株。结果表明，过量表达SP1基因的拟南芥获得了很明显高温抗性。通过检测野生型和转SP1基因的拟南芥的叶绿素含量、叶绿素荧光、含水量、脯氨酸及MDA含量等多种生理指标，验证了SP1基因过量表达提高拟南芥高温抗性的生理机制；过量表达ThpI基因的拟南芥提高了植物的低温抗性，通过检测野生型扣转ThpI基因的拟南芥的电导率、脯氨酸、MDA含量、SOD活性等多种生理指标，验证了ThpI基因过量表达提高植物耐寒性的生理基础.

目录

文摘

英文文摘

前言

论文说明：符号及缩略语说明

声明

第一部分文献综述

第一章植物抗逆分子机理及分离新基因技术的研究进展

1. 植物转录因子在逆境胁迫中的作用

2.转录因子的调控作用

3. 植物抗逆功能蛋白的研究进展

4.基因分离克隆的研究进展

5.本研究的目的及其研究内容

第二部分研究报告

第二章不结球白菜NAC类转录因子BrNAC的克隆及功能分析

1.材料与方法

2.结果与分析

3.讨论

第三章SP1功能蛋白基因的合成及功能分析

1.材料与方法

2.结果与分析

3.讨论

第四章ThpI抗冻基因的合成及功能分析

1.材料与方法

2.结果与分析

3.讨论

全文讨论与结论

本文创新点

参考文献

博士期间发表文章

致谢