Pseudomonas putida DLL-E4对硝基苯酚代谢途径中1，2，4-苯三酚1，2-双加氧酶基因的功能分析

摘要

对硝基苯酚( PNP)是重要的环境污染物，进入环境的PNP会长期残留在深层土壤和地下水中，对动植物和人类的健康造成了严重的危害。大量能够降解PNP的微生物被分离，同时在微生物许多种属中的PNP代谢途径已经得到相应的研究，但是，相应的与PNP降解相关的基因的研究却报道甚少，特别是在革兰氏阴性菌中。 本研究以本实验室分离PNP降解菌株Pseudomonas putida DLL-E4为材料，通过SEFA PCR扩增已知的部分序列1，2，4-苯三酚1，2-双加氧酶基因(pnpC)的侧翼序列。通过在NCBI的功能比对和开放阅读框(ORF)寻找以及生物学软件BioEdit开放阅读框寻找，获得了pnpC的全序列.1，2，4-苯三酚1，2-双加氧酶PnpC，不论在NCBI比对还在进化关系上都与1，2，4-苯三酚1，2-双加氧酶亲缘关系较近，可以归为1，2，4-苯三酚1，2-双加氧酶。 为了验证pnpC的功能，我们利用表达载体pET-29b对pnpC在大肠杆菌BL21中进行了表达。通过SDS-PAGE电泳分析，成功表达了pnpC。PnpC的功能是催化1，2，4-苯三酚生成maleyacetate，PnpC能够微弱地催化邻苯二酚，但不能利用对苯二酚和间苯二酚。PnpC催化1，2，4-苯三酚，最适pH是7.5，最适温度是300C。加入螯合剂EDTA会使酶活下降为原来的35.84％，金属离子对酶活性影响很大，Li+和2n2+ Mn2+，Fe3+，Cu2+，Fe2+对酶有较高的激活作用，其中Fe2+.对酶活力的激活最高。而Cd2+，Ni2+，Co2+对PnpC有抑制作用，因此PnpC有可能是金属酶。 为了验证pnpC在DLL-E4代谢PNP中的功能，在DLL-E4中对pnpC进行了敲除。通过对pnpC侧翼区进行PCR扩增，酶切pnpC绝大部分序列，获得了pnpC缺失序列并克隆至sacB自杀性质粒载体pjQ200SK中，与原始菌株DLI-E4结合后进行同源重组的方法，筛选获得了pnpC插入失活突变子DLL-ApnpC1和缺失突变子DLL-ApnpC。pnpC插入失活菌株DLL-ApnpC1只能微弱降解PNP，DLL-ApnpC并没有失去降解PNP和对苯二酚的能力，只是在降解速率上有所下降。通过分析PNP诱导的DLL-E4和DLL-ApnpC不同硫酸铵沉淀梯度下的粗酶液对邻苯二酚的活性，发现PNP诱导的DLL-ApnpC粗酶液相对Pseudomonas putida DLL-E4对硝基苯酚代谢途径中1，2，4-苯三酚1，2-双加氧酶基因的功能分析于DLL-E4的有新的活性沉淀区间出现，说明在DLL-E4中存在另一个与开环相关的双加氧酶，替代敲除的pnpC的功能，使得DLL-ApnpC的PNP完整代谢得以维持.PnpC活性分析研究结果表明其最适底物为1，2，4-苯三酚，同时该酶不能利用对苯二酚，结合本试验的结果，即PnpC确实为DLL-E4降解PNP的关键基因。又因刘智通过GC-MS确认对苯二酚为DLL-E4代谢PNP过程中的中间代谢产物。故我们推测DLL-E4中存在一条与革兰氏阴性细菌中常见的对苯二酚途径不同的PNP代谢方式，具体过程如下，PNP在单加氧酶的作用下生成对苯二酚，对苯二酚在羟化酶的作用下生成1，2，4-苯三酚，1，2，4-苯三酚在PnpC的作用下开环，进入相应循环，这个推测还需要具体的试验结果进行验证。通过分析PNP和邻苯二酚诱导的DLL-E4的不同硫酸铵沉淀梯度下的粗酶液对邻苯二酚的活性，发现PNP和邻苯二酚诱导的DLL-E4产生的粗酶液是不同酶系的，说明在DLL-E4体内存在中另一个1.2.4-苯三酚双加氧酶。 通过从NCBI上下载已报道Pseudomonas属的邻苯二酚1，2-双加氧酶蛋白质序列。通过生物学软件比对，找到保守区间，设计引物，成功的从DLL-E4基因组DNA中扩增出两个不同邻苯二酚1，2-双加氧酶基因部分序列，为全面研究苯环类物质在DLL-E4降解奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

前言

论文说明：符号与缩略语说明

声明

文献综述

一、环境污染物：对硝基苯酚

二、对硝基苯酚微生物降解的研究进展

三、Ring-Cleaving dioxygenase的研究进展

四、侧翼序列克隆方法

参考文献

第一章DLL-E4中1，2,4-苯三酚1，2-双加氧酶基因的克隆和功能分析

1.材料与方法

2.结果与分析

3.讨论

4.结论

参考文献

第二章DLL-E4对硝基苯酚降解途径关键基因pnpC的突变分析研究

1.材料与方法

2.结果与分析

3.讨论

4.结论

参考文献

全文总结

本文创新之处

附录

致谢