鱼用中药制剂“天然渔康”的研究开发

摘要

我国渔业自1990年起总产量连年位居世界首位，占全球水产品总产量的四分之一以上，呈现持续上升、稳步发展的大好局面。但水产品质量安全令人担忧，迫切需要解决病害防治、药物残留、禁用药物禁而不止等问题。中草药应用于鱼类疫病防治，既能解决上述问题，又经济。为此，我们开展了鱼用中药制剂“天然渔康”的研究开发。
　　 1不同中药组方的筛选
　　 用四个中药组方对淡水鱼常见致病菌进行抑菌效果对比试验，初步筛选中药组方。结果表明：由黄芩、鱼腥草、大黄、大蒜组成的Ⅰ号方，由黄芩、蒲公英、黄连、鱼腥草等组成的Ⅱ号方，和以大黄、五倍子、侧柏叶、大蒜等组成的Ⅳ-1、Ⅳ-2号组方具有较强的抗菌性；由板兰根、鱼腥草、地锦草、败酱草等组成的Ⅲ号配方抗菌性最弱；以大黄、五倍子、侧柏叶、大蒜等构成的Ⅳ-3、Ⅳ-4号组方抗菌活性最强。各组方对嗜水气单胞菌、哈唯弧菌、豚鼠气单胞菌、鳗弧菌、舒伯特气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、荧光假单胞菌等7种常见病原菌的MBC/MIC为：除Ⅱ号组方58-20-9的MBC/MICO为16外，其余各组方的MBC/MIC为2、4、8，均小于16，具有高度敏感性，说明这些组方对这7种病原菌具有较好的杀灭作用。
　　 2“天然渔康”的制备工艺研究
　　 为制备“天然渔康”，筛选了大黄中大黄总蒽醌和五倍子中没食子酸提取的最佳工艺条件。一是根据大黄总蒽醌的理化特性，对大黄中提取大黄总蒽醌进行回流、渗漉、温浸三种提取方法考察；选择提取溶剂、溶剂浓度、提取次数、提取时间等因素进行正交优化试验。二是根据五倍子中没食子酸的理化物性，对五倍子中提取没食子酸的酸种及其浓度进行考察。大黄中提取大黄素以回流方法最佳，总蒽醌的含量可达1.95％，高于温浸法所得的1.24％、渗漉法所得的0.90％；确立了提取总蒽醌工艺：药材粗粉加8倍量70％的乙醇回流2次，第一次5倍量乙醇2h，第二次3倍量乙醇1h,可获得大黄素含量＞0.321mg/mL、转移率＞80％。五倍子用酸水解提取没食子酸，结果硫酸水解比盐酸好，最佳提取工艺为用2.8mol/L硫酸水解3h，其提取物中没食子酸的含量可达63.91％。本工艺合理可行，有利于“天然渔康”的生产。
　　 3 TLC-HPLC法检测“天然渔康”中的大黄素
　　 建立了一种快速灵敏的测定纯中药制剂“天然渔康”中的大黄有效成分的TLC-HPLC法。大黄200g、侧柏叶509粉碎成粗粉，用70％乙醇适量加热回流，冷却至室温，滤过，减压浓缩至适量；以硅胶G为吸附剂，正己烷-醋酸乙酯-甲酸(30:10:0.5)为展开剂。色谱柱为汉邦Lichrospher C18柱（4.6×150mm,5μm）；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)；柱温27℃；检测波长245nm;流速为1.0mL/min。该方法的线性范围为0.086～1.72μg,r=0.99995（n=5）；平均回收率(n=5)为97.8％,RSD=1.8％。该方法简便、准确，重复性好，可用于“天然渔康”的质量控制。
　　 4“天然渔康”的急性毒性试验研究
　　 按照《新渔药临床检验规范》中检验方法进行测定，在pH为6.8～7.5，水温23～25℃条件下，设100、500、1000和3000 mg/kg·bw4个染毒剂量组和不加药的空白对照组进行试验，每组设3个重复，以24h、48h、96h内试验鱼致死的最低剂量和下一个剂量为最低致死剂量范围，并计算出致死率。根据直线内插法求出24h、48h、96h的半致死量(LD50)，“天然渔康”鲤鱼的96hLD50＞3000mg/kg鱼重。建鲤在整个使用“天然渔宝”过程中其摄食、体色、粪便、行为活动等均无异常改变，与对照组相比未见明显不同。
　　 5“天然渔康”的长期毒性试验研究
　　 参照《新渔药临床检验规范》要求，对纯中药制剂“天然渔康”应用于建鲤进行长期毒性试验。在整个用药过程中，建鲤摄食、体色、粪便、行为活动、主要器官解剖观察等均无异常改变。建鲤体重在给药期间均增长，与对照组相比，添加2％组的增重率显著(P＜0.05)提高了22.67％;添加0.5％、1％和4％组增重率分别提高了1.27％,6.16％，16.68％。
　　 根据新渔药研究开发要求，对“天然渔康”进行鱼类主要病原菌抑菌试验，结果表明，其对淡水鱼类细菌性败血症病原菌BSK-10、豚鼠气单胞菌ST78-3-3、鳗弧菌E-3-11、舒伯特气单胞菌CR79-1-1、荧光假单胞菌56-12-10的MIC与MBC均为25μl/L;对肠型点状产气单胞菌58-20-9的MIC与MBC均为5000μl/L，可用于这些病原菌所致相应疾病的防治。
　　 7“天然渔康”对细菌性败血症的防治试验
　　 根据《渔药临床试验技术规范》要求，对“天然渔康”淡水鱼类细菌性败血症的防治试验。结果：对鲤鱼人工感染嗜水气单胞菌保护率高剂量组（饵料添加量0.5％）为78.57％，中剂量组（饵料添加量0.1％）为85.72％，低剂量组（饵料添加量0.05％）为49.99％，药物对照组药物保护率为64.29％。“天然渔康”为鱼类细菌性败血症等疾病的防治提供了一个新途径。
　　 8“天然渔康”的临床扩大试验
　　 为确保“天然渔康”在临床应用中安全有效，对其进行临床扩大试验。在江苏、河北、广西、天津等地的细菌性感染发病的水产养殖场连续混饲内服“天然渔康”1g/kg饲料，结果显示，鱼病3～5天内死亡停止，症状减轻或消失，表明“天然渔康”对鱼类细菌感染引起的疾病有较好的治疗作用。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一章 淡水渔业概况

1 渔业发展的特点

1.1 水产养殖产品市场行情看好，养殖效益明显提升

1.2 产业结构调整效果显现，养殖布局逐步优化

1.3 优质生态渔业引领养殖业向质量效益型转变

1.4 设施养殖业取得成效，现代化水产养殖业开始起步

1.5 休闲渔业继续成为城市周边养殖业发展的出路

2 主要问题

2.1 发展空间受到限制

2.2 生产成本上升

2.3 苗种供给不足

2.4 水域环境污染日趋严重

2.5 病害发生频率高

2.6 水产品质量安全存在问题

参考文献

第二章 细菌性鱼病防治研究进展

1 病原学研究

1.1 细菌性肠炎病(Bacterial Enteritis)

1.2 细菌性烂鳃病(Bacterial Gill-rot Disease)

1.3 赤皮病(Red-skin Disease)

1.4 打印病(Stigmatosis)

1.5 竖鳞病（Lepidorthosis）

1.6 细菌性败血病(Bacterial Septicemia)

2 流行病学研究

2.1 细菌性肠炎病

2.2 细菌性烂鳃病

2.3 赤皮病

2.4 打印病

2.5 竖鳞病

2.6 细菌性败血病

3 症状及病理变化

3.1 细菌性肠炎病

3.2 细菌性烂鳃病

3.3 赤皮病

3.4 打印病

3.5 竖鳞病

3.6 细菌性败血病

4 疾病诊断学研究

4.1 传统诊断法

4.2 分子生物学诊断法

5 防治研究

5.1 细菌性肠炎病

5.2 细菌性烂鳃病

5.3 赤皮病

5.4 打印病

5.5 竖鳞病

5.6 细菌性败血病

参考文献

第三章 中草药渔业应用研究进展

1 作为饲料添加剂，提高养殖效益

1.1 发挥诱食作用，提高摄食量

1.2 降低饵料系数，提高增重率

2 作为疫病防治药，保障养殖健康

2.1 中草药防治鱼病的药理学研究

2.2 中草药对鱼类细菌性疾病的防治

2.3 中草药对鱼类病毒性疾病的防治

2.4 中草药对鱼类真菌性疾病的防治

2.5 中草药对鱼类寄生虫病的防治

参考文献

第四章 中药组方的初步筛选

1 材料

1.1 配方配制

1.2 供试菌种

1.3 培养基

2 方法

2.1 菌液制备

2.2 最低抑菌菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)测定

3 结果

3.1 Ⅰ号组方抗菌效果

3.2 Ⅱ号组方抗菌效果

3.3 Ⅲ号组方抗菌效果

3.4 Ⅳ-1号组方抗菌效果

3.5 Ⅳ-2号组方抗菌效果

3.6 Ⅳ-3号组方抗菌效果

3.7 Ⅳ-4号组方抗菌效果

3.8 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号组方抗菌效果汇总比较

4 讨论

参考文献

Preliminary prescription bolting of Chinese herbal medicine

第五章 制备工艺研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 有效组分提取研究结果

3 讨论

参考文献

Study on Preparation Technolongy of Tianran Yukang

第六章 TLC-HPLC法检测“天然渔康”中的大黄素

1 仪器与试药

2 方法

2.1 “天然渔康”的制备

2.2 薄层鉴别

2.3 含量测定

3 结果

3.1 供试品溶液制备方法选择结果

3.2 “天然渔康”中大黄素的薄层色谱图

3.3 “天然渔康”中大黄素的含量

4 讨论

4.1 供试品溶液制备条件的选择

4.2 薄层色谱条件

4.3 检测波长的选择

4.4 流动相的选择

4.5 含量测定指标的选择

4.6 样品测定结果分析

参考文献

TLC-HPLC Determination of Rhein in Tianran Yukang

第七章 急性毒性试验研究

1 材料与方法

1.1 试验动物

1.2 试验药品

1.3 试验时间与地点

1.4 试验方法

2 结果

3 讨论

3.1 “天然渔康”组方中的君药——大黄

3.2 “天然渔康”组方中的臣药——五倍子

3.3 “天然渔康”的急性毒性

参考文献

Acute Toxicity of Tianran Yukang fo Carps

第八章 长期毒性试验研究

1 材料与方法

1. 1试验药品

1. 2试验动物

1. 3试验时间与地点

1. 4试验方法

2 结果

2.1 一般状况及死亡情况

2.2 天然渔康对建鲤体重的影响

2.3 病理剖检变化

3 讨论

参考文献

Long-term Toxicity of Tianran Yukang fo Jian Carps

第九章 “天然渔康”对鱼类主要病原菌的抑菌试验

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

3 讨论

参考文献

Antibacterial Test of Tianran Yukang on Main Pathogenic Bacterium of fishes

第十章 “天然渔康”对鱼类细菌性败血症的防治试验

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 方法

2 结果

3 讨论

参考文献

Prevention and Treatment Test of Tianran Yukang on Fishery Bacterial Septicemia

第十一章 “天然渔康”的临床扩大试验

1 药品

2 方法

2.1 治疗渔场选择

2.2 使用方法

2.3 疗效评定

3 地点

4 结果

4.1 病例1

4.2 病例2

4.3 病例3

4.4 病例4

4.5 病例5

5 讨论

参考文献

Extended Clinical Trial of Tianran Yukang

全文结论

致谢

攻读博士学位期间发表的论文