苜蓿中华根瘤菌刀豆氨酸外运系统SsiR/SsiAB调控机制的研究及其对共生结瘤的影响

摘要

苜蓿中华根瘤菌可以与牧草植物苜蓿和草木樨共生结瘤。本文选择本实验室分离的苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium medicae1128为研究对象，用质粒pJZ260上的mariner转座子随机插入苜蓿中华根瘤菌以建立突变文库，用无启动子的卡那霉素抗性基因（KmR）为报告基因，以其宿主植物紫花苜蓿种子浸提物为诱导物，从中筛选到能够诱导其卡那霉素抗性基因表达的4株突变株（命名为smA，SmB，smC和smD.），经过ArbitrayPCR扩增、DNA测序以及BLAST分析后确定转座子插入的基因与LysE家族外运蛋白、组氨酸氨解酶、咪唑酮丙酸酶、NADH：黄素氧化酶基因同源。
　　 同时通过转录融合报告基因lacZ的方法证实ssiA以及其下游基因ssiB都能被种子浸提物及刀豆氨酸诱导，但诱导能力不同，ssiA-lacZ比ssiB-lacZ的诱导能力强。通过不同的氨基酸诱导asiA-lacZ和ssiB-lacZ发现，ssiA-1acZ和ssiB-lacZ都能被刀豆氨酸诱导，而其他的常见碱性氨基酸不能诱导其表达，通过比对发现，ssiA基因与中慢生型天山根瘤菌的刀豆氨酸外运基因msiA具有75％的同源性，可能为刀豆氨酸外运有关的基因，而ssiB却与之没有同源性。而后通过基因敲除和互补表达asiA上游ssiR的方法证明，和LysR类转录调节蛋白同源的SsiR蛋白可能是asiA和ssiB基因的转录调节蛋白，此蛋白也与中慢生型天山根瘤菌的msiA的调节蛋白MsiR有75％的同源性。
　　 在体外无酵母粉含量的情况下，刀豆氨酸对ssiA和ssiB单独缺失和同时缺失的突变株的毒性要比野生型高，同时发现ssiA缺失突变株比ssiB缺失突变株对刀豆氨酸更敏感，ssiAB对不同的浓度的刀豆氨酸敏感程度也不同，这说明虽然可能ssiA和ssiB表达的蛋白可能都为刀豆氨酸外运蛋白，但外运能力不同。
　　 根毛吸附实验和共生结瘤实验发现，ssiA，ssiB和同时缺失都能导致吸附能力的降低，这是由于突变株对苜蓿分泌的大量的刀豆氨酸敏感造成的。随后的共生结瘤实验发现前期ssiA和ssiAB的突变株都能造成结瘤数的下降和结瘤率的下降，但45天后差异更小或没有差异，很可能是随着植株的生长，分泌的刀豆氨酸减少造成的。
　　 根据上述试验数据提出苜蓿根瘤菌Sinorhizobiun medicae1128的SsiR/SsiAB系统和其宿主苜蓿种子浸提物中刀豆氨酸的互作模型：在苜蓿生长初期，种子和植株分泌大量的杀菌物质刀豆氨酸刀豆氨酸可能杀死植株周围潜在的有害细菌，而对苜蓿生长有益的苜蓿根瘤菌，由于ssiAB基因编码的蛋白可以将对细菌有毒性的刀豆氨酸运出细胞，使得苜蓿根瘤菌可以在苜蓿根际成为优势菌株，为进一步共生结瘤提供了条件，这也可能是豆科植物与根瘤菌协同进化的结果。

目录

文摘

英文文摘

文献综述

一.总论

二.植物和根瘤菌间相互作用的信号交流

三.LYSE家族

四.L-刀豆氨酸

五.根瘤菌分类研究的现状

参考文献

第一章 苜蓿中华根瘤菌由种子浸提物诱导基因的筛选

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果和分析

4.小结与讨论

参考文献

第二章 苜蓿中华根瘤菌SSIAB基因调控基因的鉴定

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果及其分析

4.小结与讨论

参考文献

第三章 苜蓿中华根瘤菌刀豆氨酸外运系统SSIR/SSIAB功能的研究

1 实验材料

2 实验方法

3.试验结果与分析

4.小结与讨论

参考文献

全文总结

附录一 文中所用缩写

附录二 文中所用的试剂和培养基配方

附录三 攻读硕士学位期间发表或待发表的论文

致 谢