海蛙(Fejervarya cancrivora)皮肤分泌液中抗菌多肽的分离纯化、分子克隆以及结构与功能的研究

摘要

两栖类动物皮肤是生物活性物质丰富的资源库，其皮肤中含有的生物活性物质种类繁多、功能复杂，这些活性物质可用来保护机体抵御有害环境因子的侵袭。迄今为止，已从两栖类动物皮肤中分离鉴定出许多具有不同生物活性的蛋白以及多肽。海蛙作为唯一能在海水中生活的两栖类动物，由于特殊的生活环境，其生理调节机制和生物活性物质必定和淡水蛙有所不同，到目前为止未有关于海蛙活性物质的报道。本论文以海蛙(Fejervarya cancrivora)为试验材料，对其皮肤分泌液中抗菌肽进行分离纯化、结构和功能的研究。
　　 通过Sephadex G-50凝胶过滤层析和反相高压液相层析（RP-HPLC）的分离纯化，从海蛙皮肤分泌物中分离到3种抗菌肽，其序列分别是GSAQPYKQLHKvvNWDPYG、RVCSAIPLPICH和RVCMAIPLPLCH，这是第一次关于海蛙抗菌肽的报道。其中一个由19个氨基酸残基组成，不合有半胱氨酸，结构中富含杂环氨基酸和碱性氨基酸，整个分子带正电荷，通过同源性比对发现，它与大多数蛙科来源的抗菌肽不同，和目前已知的任何蛋白没有显著的相似性，是一个崭新的抗菌肽家族，将其命名为cancrin。另外两个12个氨基酸组成的多肽和目前仅在虎纹蛙中发现的tigerinin-2抗菌肽类似，存在1～2个氨基酸的差异，结构中两个半胱氨酸形成的二硫键形成一个九肽环，因含有多个碱性氨基酸残基而使整个分子带正电荷，将其命名为tigerinin-RCl和tigerinin-RC2。
　　 用海蛙皮肤中提取的mRNA为材料，建立了海蛙皮肤的cDNA文库。根据设计的抗菌肽引物，从海蛙皮肤cDNA文库中克隆抗菌肽的编码基因，共筛选出22个阳性克隆.测序结果表明，上述22个基因编码17个不同的抗菌肽前体.进一步分析这17条基因后发现，这些基因编码4个不同的成熟肽cancrin A1、cancrin A2、tigerinin-RCl以及tigerinin-RC2，将其分别归属于cancrin和tigerinin抗菌肽家族.cancrin家族的前体蛋白有68个氨基酸残基组成，包括22个残基组成的信号肽区域和由19个氨基酸残基组成的成熟肽cancrin A1和cancrin A2。 tigerinin-RC前体蛋白有71个氨基酸残基组成，包括22个残基组成的信号肽和由12个氨基酸残基组成的成熟肽tigerinin-RCl和tigerinin-RC2，这也是关于编码tigerinin抗菌肽家族的基因序列的第一次报道.这两个抗菌肽家族的整体结构均由三部分组成：信号肽-间隔肽-成熟肽。信号肽和Rana科抗菌肽家族的信号肽类似，比较保守；间隔肽是由以KR酶切位点结束的酸性肽组成；成熟肽则具有抗菌肽的典型特征，含有多个碱性氨基酸，整个区域带正净电荷；整体结构和其他两栖类物种中发现的抗菌肽很相似，所不同的是海蛙这两个抗菌肽家族的成熟肽的一级结构和其他两栖类抗菌肽的结构差异很大。根据tigerinin和cancrin前体结构与蛙科抗菌肽前体序列的相似性，我们推测这类抗菌肽可能来自同一祖先，长期的自然选择使它们共同的祖先基因发生了分化，进化出不同的功能和防御机制。对这三个区域氨基酸的同义突变和错义突变的分析表明，各区域的同义突变突变速率基本相同，信号肽和间隔肽的基因中非同义替代的速率高于同义替代，成熟肽中非同义替代的速率远远低于同义替代。这种从信号肽，到间隔肽，再到成熟肽，错义突变速率越来越低的现象，成熟肽区域密码子的突变特征符合新达尔文进化理论中净化选择的现象，推测这个家族的抗菌肽在海蛙体内发挥着重要的功能。
　　 以大肠杆菌（Escherichia coli, E.coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S.aureus），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis, B.subtilis），白色念珠菌(Candida albicans, C.albicans)，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa, P.aeruginosa)为测试菌株，研究cancrin、tigerinin-RCl和tigerinin-RC2的抗菌活性，分析结果表明，它们均具有广谱、有效的抗菌活性.Cancrin对革兰氏阳性菌S.aureus和B.subtilis、真菌 C.albicans具有较强的杀灭作用，其中对S.aureus ATCC25923作用最强，MIC为15μ g·ml-1；但cancrin对革兰氏阴性菌E.coli ATCC25922作用较弱，样品浓度为120ug· ml-1时抑菌效果仍不明显，而tigerinin家族的抗菌谱和抗菌活性比cancrin要强，除对上述菌株有效外，还对P.aeruginosa有效，其MIC为10μg· ml-1。
　　 对这两个抗菌肽家族的毒性试验表明，它们对兔红细胞的裂解能力都比较弱，溶血活性不强，表明它们对真核细胞的毒性较低，这对于它们进一步用于临床提供了很好的前提条件.
　　 对cancrin抗菌肽的功能研究表明，它不具有促进肥大细胞脱粒、促或抗组胺释放功能，没有检测出丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性和红细胞凝集的活性，但具有抗氧化活性，表现出强烈的自由基清除能力.
　　 通过上述的工作，证实了海水中和淡水中生活的的两栖类动物的先天防御体系中有共同的成分，如tigerinin抗菌肽家族.此外，针对其所面临的不同的的海洋微生物，海蛙进化出一个独特的cancrin抗菌肽家族。根据目前体外功能活性所检测出的结果，可以推测这种小分子肽可能具有独特的防御机制.研究海蛙的抗菌肽对揭示抗菌肽基因的形成和进化机制，活性和构效关系具有重要意义，也为研制新型临床抗菌药物提供了前体化合物.

目录

文摘

英文文摘

缩略词对照表

第一章 文献综述

一 两栖类系统生物学

二 两栖类的皮肤活性物质

三 抗菌肽和先天免疫

1、抗菌肽

2、Cathelicidins

3、防御素

4、AMPs的表达与调控

5、AMPs的抗菌活性

6、AMPs调节的宿主炎症反应

7、AMPs的趋化活性

8、依赖于TLR的炎症反应调节

9、促进伤口愈合

10、AMPs涉及的疾病

11、微生物对AMPs的抗性

四 海蛙的研究概况

参考文献

第二章 海蛙皮肤分泌液中抗菌肽的分离纯化与分子克隆

一 材料与方法

1、试验材料

2、样品收集

3、抗菌活性检测

4、抗菌肽的分离纯化

5、抗菌肽的结构分析

6、海蛙皮肤cDNA的合成

7、海蛙皮肤cDNA文库的构建

8、海蛙皮肤抗菌肽的分子克隆

9、海蛙抗菌肽cDNA序列的进化遗传数据分析

二 结果与讨论

1、海蛙皮肤抗菌肽的分离纯化

2、海蛙皮肤抗菌肽的分子质量与一级结构

3、海蛙皮肤cDNA文库构建

4、海蛙皮肤抗菌肽的分子克隆

5、海蛙皮肤抗菌肽结构分析

6、海蛙抗菌肽cDNA序列的进化遗传学分析

三 小结

参考文献

第三章 海蛙皮肤抗菌肽的生物功能研究

一 材料与方法

1、样品合成

2、功能研究

二 结果与讨论

1、抗菌活性及最小抑菌浓度( MIC)

2、溶血、出血及血浆凝固活性检测

3、肥大细胞脱粒及组胺释放

4、抗氧化活性

5、红细胞凝集活性

6、胰蛋白酶水解活性检测

7、胰蛋白酶抑制剂活性检测

三 小结

参考文献

全文总结

创新之处

致谢

攻读学位期间发表的论文、发明专利

附录 20中常用氨基酸表