拟茎点霉(Phomopsis sp.)By254的次生代谢产物研究

摘要

植物内生真菌能产生丰富的次生代谢产物，这些次生代谢产物通常具有抗菌、抗肿瘤等重要生物活性。本论文所研究的植物内生真菌By254由本实验室分离自中国江苏省南通市的棉花根内。通过形态学和分子生物学手段鉴定其属于拟茎点霉（Phomopsis sp.）；对其发酵产物进行分离和纯化，并结合活性检测，最终从该菌发酵产物中分离得到3种细胞松弛素和22种挥发油成分。主要研究内容包括以下几方面：
　　 首先，对从棉花根内分离到一株内生真菌By254进行形态学和分子生物学鉴定，通过观察其在PDA和OMA培养基上的菌落形态及其产生的分生孢子特征进行了初步鉴定，结合ITS基因的测序结果鉴定该菌株属于拟茎点霉属（Phomopsis sp.）真菌。
　　 其次，用小米麸皮培养基对拟茎点霉By254进行固体发酵，并对其活性代谢产物进行分离和鉴定。利用柱层析，薄层层析和高效液相色谱等方法，并结合活性追踪检测，从其发酵产物中分离到三种次生代谢产物（化合物1，2，3），通过质谱（ESI-MS）、核磁共振（1H-NMR，13C-NMR，DEPT135，HMQC，HMBC，1H-1H COSY，NOESY）等方法鉴定三种化合物均为细胞松弛素（cytochalasin），化合物1，2，3分别为epoxycytochalasin H，cytochalasin N和cytochalasin H。
　　 再次，通过纸碟法测定这三种化合物对10种植物病原真菌（终极腐霉、小麦赤霉病菌、油菜菌核病菌、玉米小斑病菌、棉花枯萎病菌、辣椒疫霉、番茄灰霉病菌、小麦根腐病菌、小麦全蚀病菌、小麦纹枯病菌）和10种植物病原细菌（金黄色短小杆菌、萎蔫短小杆菌萎蔫致病变种、燕麦嗜酸菌属西瓜亚种、密执安棒状杆菌环腐亚种、密执安棒状杆菌密执安亚种、密执安棒状杆菌布拉斯亚种、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种、野油菜黄单胞杆菌水稻致病变种、带化红球菌、青枯劳尔氏菌）的抑制作用，结果显示，三种化合物对除辣椒疫霉外的其余9种病原真菌都有一定的抑制作用，对病原细菌均无抑制作用。通过生长速率法进一步测定了三种化合物对这9种病原真菌的抑制中浓度（IC50），结果显示：除了化合物1对终极腐霉和化合物2对小麦赤霉病菌的抑制作用较弱以外，3种化合物对其余病原真菌都有较强的抑制作用，IC50为0.15-57.32μg/mL。这三种化合物对本文中测试植物病原菌的抑菌活性研究为首次报道。
　　 最后，本文对拟茎点霉By254产生的挥发油成分进行了研究。通过有机溶剂萃取其固体发酵产物中的挥发油组分，并进行甲酯化处理，采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术，首次对其挥发油成分进行了分析。结果表明，从拟茎点霉By254中共分离鉴定出22种成分，占总挥发油量的93.0％。其中脂肪酸占92.6％，主要包括：硬脂酸（18.7％）、14.甲基-十五烷酸（16-3％）、8-11-十八碳二烯酸（15.5％）、棕榈酸（8.1％）和11-十八碳烯酸（7.2％）等，不饱和脂肪酸占41.6％。本研究首次分析拟茎点霉中的挥发油成分。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

符号及缩略语

第一章 文献综述

1 植物内生真菌及其代谢产物的研究进展

1.1 植物内生真菌简介

1.2 植物内生真菌代谢产物的开发和应用

2 拟茎点霉的次生代谢产物研究

2.1 拟茎点霉的研究概况

22 拟茎点霉的次生代谢产物

3 细胞松弛素的概念及生物活性

4 本课题的研究目的,内容和意义

第二章 棉花内生真菌By254的分离与鉴定

1 材料与方法

1.1 供试植物

1.2 真菌及其培养

1.3 内生真菌的分离及保存

1.4 内生真菌的固体发酵

1.5 内生真菌发酵产物对病原真菌的拮抗实验

1.6 内生真菌By254的形态学鉴定

1.7 内生真菌By254的分子生物学鉴定

2 结果与分析

2.1 棉花内生真菌的分离

2.2 内生真菌发酵产物对病原真菌的拮抗

2.3 内生真菌By254的形态学鉴定结果

2.4 内生真菌By254的分子生物学鉴定结果

3 小结与讨论

3.1 植物内生真菌的鉴定

3.2 拟茎点霉的潜在应用价值

第三章 拟茎点霉By254活性次生代谢产物的分离与鉴定

1材料与方法

1.1 菌株来源

1.2 拮抗测定指示菌

1.3 常用的培养基

1.4 拟茎点霉By254的发酵

1.5 菌株By254发酵产物的分离

1.6 菌株By254分离产物的结构测定

1.7 菌株By254分离产物的抑菌活性测定

1.8 菌株By254分离产物对病原真菌的IC50测定

2 结果与分析

2.1 拟茎点霉By254的发酵产物

2.2 菌株By254发酵产物的分离

2.3 化合物1-3的理化性质和结构鉴定

2.4 化合物1-3对病原菌的抑制活性测定

2.5 化合物1-3对病原真菌的IC50测定

3 小结与讨论

第四章 拟茎点霉By254的挥发油成分研究

1材料与方法

1.1 菌株及其发酵

1.2 拟茎点霉By254中挥发油的提取及甲酯化

1.3 GC/MS分析条件

2 结果与分析

2.1 拟茎点霉By254的挥发油成分

3 小结与讨论

参考文献

附录一 By254的ITS序列测定结果

附录二 化合物1-3的波谱数据

文章及专利

致谢