基因枪法和农杆菌介导二穗短柄草(Brachypodium distachyon)成熟胚愈伤组织的遗传转化

摘要

二穗短柄草（Brachypodium distachyon）是一种广泛分布于温带地区的禾本科植物，基因组小、染色体少、DNA重复序列少、植株较矮、生育期短、不需要严格的生长条件和栽培措施，与小麦族植物一样具有二倍体、四倍体和六倍体，是一种新型的禾草模式植物。在禾谷类转基因研究中，成熟胚因其取材方便，生理状态一致，而成为组织培养和遗传转化理想的外植体。本实验采用农杆菌介导法和基因枪转化法同时应用于二穗短柄草成熟胚愈伤组织的遗传转化上，并对其转化效率以及转基因在植物中的表达情况进行了研究。主要结果如下：
　　 1.二穗短柄草高效离体再生体系的建立
　　 以二穗短柄草三个品系BD21，BD21-3和BDR018成熟胚为外植体，研究了2，4-D浓度和硫酸铜对愈伤组织诱导率的影响及愈伤组织年龄对再生的影响。结果表明：添加0.6 mg/L，CuSO4和2.5 mg/L2，4-D的MS2.5+Cu诱导培养基上，胚性愈伤组织的诱导率最高，三个品系的诱导率分别为86.2％，85.0％和72.3％。愈伤组织年龄为7周时再生率最高，分别为98.1％，99.3％和83.3％。随愈伤组织年龄的增加，再生率降低，白化率升高。
　　 2.二穗短柄草遗传转化体系的建立
　　 选取年龄75 d的BD21和BD21-3品系的胚性愈伤组织为受体材料。用包被有质粒pDM803，J34和J53的金粉-DNA混合液轰击，经过抗性愈伤组织的筛选和抗性植株再生，统计转化率。结果表明：在基因枪转化法中，BD21和BD21-3用质粒J34轰击的平均转化率最高分别为7.2％和13.5％，而质粒pDM803转化率最低。农杆菌介导转化的最高转化率为13.8％。0.01％Silwet L-77、真空处理及添加AS均可显著提高转化率。
　　 3.抗性植株的检测
　　 通过GUS组织化学染色，农杆菌介导的植株中有62.7％的植株能够在植物体内稳定表达。而基因枪转化的植株中只有30％。经过PCR检测，除了非转基因对照植株以外，所有的抗性植株均扩增出了357 bp的bar基因DNA片断。利用Basta除草剂对T1代植株进行喷洒筛选，初步确定bar基因的分离规律完全符合孟德尔遗传分离规律。

目录

文摘

英文文摘

主要缩略语

1 文献综述

1.1 农杆菌介导单子叶植物遗传转化的研究进展

1.1.1 农杆菌介导的遗传转化机理

1.1.2 农杆菌介导的遗传转化特点及影响因素

1.1.3 农杆菌介导的单子叶植物遗传转化进展

1.2 基因枪法介导的直接基因转化的研究进展

1.2.1 基因枪转化法的基本原理及基因枪的基本类型

1.2.2 基因枪介导转化的特点及影响因素

1.2.3 基因枪介导转化单子叶植物的研究进展

1.3 新型禾草模式植物-二穗短柄草(Brachypodium distachyon)的研究进展

1.3.1 新型禾草模式植物-二穗短柄草

1.3.2 二穗短柄草的生物学特性、基因组大小和分类地位

1.3.3 二穗短柄草遗传转化研究进展

1.4 转基因植物的筛选和鉴定

1.4.1 报告基因

1.4.2 选择标记基因

1.4.3 转基因植物的分子生物学检测

1.5 工作的目的和意义

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 二穗短柄草成熟胚离体再生体系的建立

2.2.2 农杆菌法对二穗短柄草进行bar基因的遗传转化

2.2.3 基因枪轰击法转化二穗短柄草

2.2.4 gus基因表达检测

2.2.5 转化植株的PCR鉴定

2.2.6 T1代的BASTA检测

3 结果与分析

3.1 二穗短柄草成熟胚离体再生体系的建立

3.1.12,4-D浓度和CuSO4对愈伤组织诱导的影响

3.1.2 愈伤组织年龄对愈伤组织分化再生的影响

3.2 基因枪法和农杆菌介导法转化二穗短柄草的研究

3.2.1 基因型和质粒对基因枪法转化二穗短柄草转化效率的影响

3.2.2 农杆菌介导法转化二穗短柄草的研究

3.3 抗性愈伤组织及转基因植株的筛选

3.3.1 基因枪法转化抗性愈伤组织和再生植株的筛选

3.3.2 农杆菌介导的转化抗性愈伤组织和再生植株的筛选

3.4 转基因植株的鉴定

3.4.1 gus基因表达

3.4.2 转基因植株的PCR检测

3.4.3 T1代的抗性分离

4 讨论

4.1 二穗短柄草成熟胚离体再生体系的建立

4.2 基因枪法介导不同质粒转化二穗短柄草

4.3 农杆菌介导转化二穗短柄草条件优化

4.4 转基因植株的检测

5 结论

参考文献

致 谢

研究生期间发表的论文

附图