污水处理中脱氮功能微生物特性及固定化应用研究

摘要

随着水体富营养化的日趋严重与污水排放标准、氮素限值的日趋严格，水中氮素的去除已成为当今水污染防治的热点问题之一。生物脱氮是从废水中去除氮素污染的最为经济有效的方法，可实现真正意义的氮去除。目前为止，尽管传统生物脱氮工艺是多数废水生物脱氮处理的主要承担者，但仍存在着硝化速率低、工艺复杂、脱氮效率低等缺点。而在氮素循环过程中发现的新型脱氮微生物，可以克服传统生物脱氮工艺固有的问题，对这些微生物的研究与新型脱氮工艺开发，是对传统生物脱氮理论与实践的丰富与突破。本文从活性污泥中分离出一株异养硝化/好氧反硝化细菌A1、一株高效缺氧反硝化细菌D6，研究了两株细菌以及已有的好氧反硝化细菌AD6脱氮过程的生态影响因子。同时考察了Ca2+在好氧颗粒污泥形成中的作用，确定了SBR中快速培育好氧颗粒污泥的条件。在此基础上，将分离、鉴定的3株脱氮功能菌以好氧颗粒污泥形式固定化，研究了其在开放的污水处理系统中的作用与稳定性，构建了基于微生物及环境因子的同步硝化与反硝化工艺(Simultaneous Nitrification and Denitrification, SND)。本文主要研究结果为：
　　 从活性污泥中分离得到一株异养硝化细菌A1，通过形态学、生理生化特征并结合16SrDNA序列同源性分析，初步鉴定该菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。菌株A1可以自养生长。当培养液NH4+为105.58、257.23mg/L时，菌株A1培养120h，培养液COD可达94.77、90.26mg/L，对NH4+去除率为36.32％、19.53％，对TN去除率为24.88、13.09％;当NH4+为536.21、1014.17mg/L时，菌株A1生长受到抑制，培养120h，培养液COD分别为56.80、33.56mg/L，菌株A1对NH4+去除率仅有6.54％、2.26％，对TN去除率仅为4.07％、2.27％，基本没有脱氮效果。考察了碳源种类与数量对菌株A1脱氮特性的影响。葡萄糖、柠檬酸盐、丁二酸盐、乙酸盐4种碳源对菌株A1脱氮特性的影响没有明显差异，以乙酸盐为碳源时，最大COD、NH4+、TN去除效率分别为71.08％、60.35％、52.22％。培养液碳源为乙酸盐，菌株A1在C/N值为6、12时，对COD,TN，NH4+去除效率较高，分别为79.35％、71.08％,59.21％、52.22％，67.07％、60.35％，培养过程中培养液DO始终大于4.01mg/L。由此，菌株A1具有异养硝化/好氧反硝化功能。
　　 通过菌株形态观察、生理生化特征及16SrDNA序列分析，鉴定一株可进行好氧反硝化作用的细菌AD6为假单胞菌属门多萨菌（Pseudomonasmendocina）。采用摇瓶试验，研究了C/N值，培养液DO及柠檬酸盐、乙酸盐、葡萄糖3种有机碳源，NH4+、NO2ˉ和NO3ˉ3种氮源对好氧反硝化细菌AD6脱氮特性的影响。C/N值不仅直接影响好氧反硝化过程中碳源数量，也显著影响培养液DO变化。起始C/N值为3时，因碳源数量不够而导致AD6好氧反硝化脱氮效率仅有41.71％；当起始C/N值为23、15、8时，培养液DO先快速下降至缺氧状态然后再升至好氧状态，反应末期TN损失率分别为69.33％、70.41％、55.40％，其中好氧阶段反硝化作用引起的TN损失约为6.93％、20.09％、24.60％。培养液起始DO为7.15～8.08mg/L,C/N值为15及以下，摇瓶(250mL三角瓶)装液量为25～100mL，摇床转速为180r/min，培养液DO先下降至缺氧状态，但可在反硝化反应进行24h后恢复至好氧状态，减少摇瓶装液量的充氧措施提高培养液DO效果有限。柠檬酸盐与乙酸盐是AD6能够高效利用的碳源，利用率可达89.64％、92.11％，而同样条件下葡萄糖的利用率仅有40.56％。乙酸盐促进了AD6的好氧反硝化功能，TN去除率、好氧反硝化脱氮效率分别比以柠檬酸盐为碳源时高13.63％、5.18％。该菌株可分别以NH4+、NO2ˉ和NO3ˉ为起始氮源进行生长与脱氮作用，培养29～33h达到最大氮去除效率，分别为16.57％、74.84％与74.61％,AD6表现出微弱的异养硝化/好氧反硝化功能。
　　 从活性污泥中分离筛选出一株高效缺氧反硝化细菌D6，通过形态学、生理生化特征并结合16SrDNA序列同源性分析，初步鉴定该菌为施氏假单胞菌（PseudomDnasstutzeri)。当C/N值为6、12时，菌株D6经过54h培养，COD、TN去除效率可分别达到90％、80％以上。柠檬酸盐、乙酸盐是菌株D6反硝化过程中能高效利用的碳源，当C/N值为6，培养54h后，可分别取得80.72％、74.75％的TN去除率以及90.53％、86.30％的COD去除率；同样培养条件下，菌株D6以葡萄糖为碳源，TN与COD去除率分别只有56.56％、74.64％。当C/N值为6,NO3ˉ浓度为182.38～358.30mg/L，菌株D6脱氮效率不受NO3ˉ浓度影响，可达80.72～82.50％。采用摇床振荡培养与培养箱静置培养2种方式考察菌株D6的反硝化特性，发现当培养液DO大于1.0mg/L，菌株D6的反硝化特性基本被抑制。
　　 通过运行序批式生物反应器(Sequencing Batch Reactor， SBR)与摇瓶试验相结合方法，在进水中投加不同数量Ca2+(0～200mg/L)，考察了Ca在好氧颗粒污泥形成中的作用。设计了进水Ca2+含量分别为30(Ⅰ)、100mg/L(Ⅱ)的2组SBR试验，运行20d后，两反应器中均出现了好氧颗粒污泥。运行前50d，SBR I中颗粒污泥浓度(Mixed Liquor Suspended Solid,MLSS)与污泥沉降指数（SludgeVolumeIndex,SVI）指标明显好于SBRⅡ；运行后期，SBRⅠ、Ⅱ中MLSS、SVI差异很小。反应器运行与摇瓶试验表明，当进水中Ca2+为0～200mg/L，进水中Ca2+含量的增加对污泥Zeta电位影响很小，没有引起好氧颗粒污泥Zeta电位的明显差异，电中和在颗粒污泥形成过程中并不起重要作用。随着进水Ca2浓度增加，颗粒污泥中的微生物数量与种类都逐渐丰富，Ca2+有助于促进污泥中微生物多样性。接种污泥及SBR中颗粒污泥的元素含量分析表明，颗粒污泥中Ca、Mg、K、Na含量均有所减少，Fe含量分别增加了4.42％、7.82％。具有良好絮凝作用的金属离子与EPS间形成的高分子生物聚合体可能是促进好氧颗粒污泥形成的主要原因。采用2套相同的模拟SBR装置，配制典型的高浓度生活污水，在上述运行条件下均形成好氧颗粒污泥。其中1套模拟SBR装置在好氧颗粒污泥形成过程中，按7天1次的频率投加了3次A1、AD6、D6的混合菌液。60d运行试验结果表明，投加功能菌的SBR中形成了具有良好脱氮效果的好氧颗粒污泥，对COD、TN、NH4+的去除效率分别达到96.53％、85.59％、99.54％，比普通好氧颗粒污泥分别高2.02％、22.16％、5.31％，反应过程中NO3ˉ、NO2ˉ的积累量很少，出水中COD、TN、NH4+浓度可以稳定地达到城镇污水处理厂污染物排放标准(GB18918-2002)一级A标准，具有较好的同步脱氮除碳功能。对装置运行过程中颗粒污泥PCR-DGGE图谱的动态研究分析表明，接入的异养硝化/好氧反硝化细菌A1、好氧反硝化细菌AD6、缺氧反硝化细菌D6能够固定在颗粒污泥中，在SBR反应器中具有一定的数量优势，有助于功能菌长期稳定的发挥脱氮功能。
　　 全文研究表明，异养硝化菌株A1、好氧反硝化菌株AD6、缺氧反硝化菌株D6均具有氮脱除功能，但菌株类型不同，生态因子如有机物浓度、碳源种类、DO、氮源等对脱氮特性的影响存在明显差异。将3类脱氮功能菌组合，形成好氧颗粒污泥，能有效将功能菌固持在开放的污水处理系统中，形成具有同步脱氮除碳性能的SND工艺，稳定高效地去除污水中有机物与氮素。异养硝化细菌和好氧反硝化细菌能够在生物同步脱氮中起重要的作用，为微生物学理论解释SND现象提供了微生物学理论依据；同时，缺氧反硝化细菌D6在颗粒污泥中的固定，表明好氧颗粒污泥中存在发生SND的环境因素。研究结果为全面评价SND工艺提供了基础研究，以颗粒污泥形式固定功能菌株为新型脱氮微生物应用于污水处理实践提供了新的途径。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 传统生物脱氮技术

1.1.1 好氧硝化

1.1.2 缺氧反硝化

1.2 新型生物脱氮技术

1.2.1 异养硝化

1.2.2 好氧反硝化

1.2.3 同步硝化反硝化

1.3 微生物固定化技术

1.3.1 微生物固定化技术与高效功能菌

1.3.2 好氧颗粒污泥自固定化技术

1.4 本论文研究目的、主要内容与技术路线

1.4.1 研究目的

1.4.2 主要内容

1.4.3 技术路线

参考文献

第二章 材料与方法

2.1 异养硝化细菌的分离及特性研究

2.1.1 氨氧化细菌的富集

2.1.2 水洗琼脂平板的制作

2.1.3 异养硝化细菌的分离与纯化

2.1.4 异养硝化细菌的筛选

2.1.5 菌株A1自养生长时的脱氮特性

2.1.6 NH4+浓度对菌株A1自养脱氮特性的影响

2.1.7 培养方式对菌株A1自养脱氮特性的影响

2.1.8 碳源种类对菌株A1异养脱氮特性的影响

2.1.9 碳源数量对菌株A1异养脱氮特性的影响

2.2 好氧反硝化细菌的鉴定及特性研究

2.2.1 好氧反硝化细菌AD6的反硝化作用

2.2.2 C/N值对好氧反硝化细菌AD6脱氮特性的影响

2.2.3 供氧条件对好氧反硝化细菌AD6脱氮特性的影响

2.2.4 碳源种类对好氧反硝化细菌AD6脱氮特性的影响

2.2.5 氮源种类对好氧反硝化细菌AD6脱氮特性的影响

2.3 缺氧反硝化细菌的分离、鉴定及特性研究

2.3.1 缺氧反硝化细菌的富集培养

2.3.2 缺氧反硝化细菌的分离与纯化

2.3.3 缺氧反硝化细菌的初筛

2.3.4 高效缺氧反硝化细菌的筛选

2.3.5 缺氧反硝化细菌D6的脱氮特性

2.3.6 C/N值对缺氧反硝化细菌D6脱氮特性的影响

2.3.7 碳源种类对缺氧反硝化细菌D6脱氮特性的影响

2.3.8 NO3ˉ浓度对缺氧反硝化细菌D6脱氮特性的影响

2.3.9 培养方式对缺氧反硝化细菌D6脱氮特性的影响

2.4 细菌的生理生化特征及分子生物学鉴定

2.4.1 形态学特征分析

2.4.2 生理生化特征测定

2.4.3 菌株16SrDNA鉴定

2.4.4 颗粒污泥总DNA提取

2.4.5 PCR扩增

2.4.6 DGGE操作步骤

2.5 脱氮功能菌株固定化试验

2.5.1 试验接种污泥

2.5.2 SBR Ⅰ、Ⅱ运行试验

2.5.3 摇瓶试验

2.5.4 SBR与摇瓶试验进水水质

2.5.5 模拟SBR运行试验

2.5.6 模拟SBR进水水质

2.6 试验测试项目

2.6.1 COD测定

2.6.2 N、P测定

2.6.3 DO、pH测定

2.6.4 活性污泥参数测定

2.6.5 光密度D600测定

2.6.6 微生物形态与种类观察

2.6.7 污泥元素含量与表面电荷测定

参考文献

第三章 异养硝化细菌的分离、鉴定及脱氮特性研究

3.1 异养硝化细菌的筛选

3.2 异养硝化细菌A1的鉴定

3.2.1 菌株A1的形态和生理生化特征

3.2.2 菌株A1的16SrDNA鉴定

3.3 菌株A1自养生长时的脱氮特性

3.3.1 NH4+浓度对菌株A1自养脱氮特性的影响

3.3.2 培养方式对菌株A1自养脱氮特性的影响

3.4 菌株A1异养生长时的脱氮特性

3.4.1 碳源种类对菌株A1异养脱氮特性的影响

3.4.2 碳源数量对菌株A1异养脱氮特性的影响

3.5 小结

参考文献

第四章 好氧反硝化细菌的鉴定及脱氮特性研究

4.1 好氧反硝化细菌AD6的反硝化作用

4.2 好氧反硝化细菌AD6的鉴定

4.2.1 菌株AD6的形态和生理生化特征

4.2.2 菌株AD6的16SrDNA鉴定

4.3 好氧反硝化细菌AD6的脱氮特性与影响因素

4.3.1 C/N值对好氧反硝化细菌AD6脱氮特性的影响

4.3.2 供氧条件对好氧反硝化细菌AD6脱氮特性的影响

4.3.3 碳源种类对好氧反硝化细菌AD6脱氮特性的影响

4.3.4 氮源种类对好氧反硝化细菌AD6脱氮特性的影响

4.4 小结

参考文献

第五章 缺氧反硝化细菌的分离、鉴定及脱氮特性研究

5.1 高效缺氧反硝化细菌的筛选

5.2 缺氧反硝化细菌D6的鉴定

5.2.1 菌株D6的形态和生理生化特征

5.2.2 菌株D6的16SrDNA鉴定

5.3 缺氧反硝化细菌D6的脱氮特性与影响因素

5.3.1 缺氧反硝化细菌D6的脱氮特性

5.3.2 C/N值对缺氧反硝化细菌D6脱氮特性的影响

5.3.3 碳源种类对缺氧反硝化细菌D6脱氮特性的影响

5.3.4 NO3ˉ浓度对缺氧反硝化细菌D6脱氮特性的影响

5.3.5 培养方式对缺氧反硝化细菌D6脱氮特性的影响

5.4 小结

参考文献

第六章 脱氮功能微生物的固定化应用研究

6.1 Ca2+在好氧颗粒污泥形成中的作用

6.1.1 SBR中混合液SVI、MLSS、DO变化

6.1.2 SBR与摇瓶中污泥Zeta电位变化

6.1.3 SBR与摇瓶中污泥微生物相变化

6.1.4 接种污泥与SBR中颗粒污泥成分分析

6.1.5 SBR中颗粒污泥的活性测定

6.2 脱氮功能菌株自固定化

6.2.1 固定脱氮菌株的好氧颗粒污泥的培育

6.2.2 固定脱氮菌株的好氧颗粒污泥形成过程中微生物相变化

6.2.3 固定脱氮菌株的颗粒污泥与普通颗粒污泥对水质的净化效果

6.3 好氧颗粒污泥中脱氮功能微生物的动态变化

6.4 小结

参考文献：

全文结论

论文的创新点

论文不足与展望

致谢

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