高效氟吡甲禾灵和精吡氟禾草灵酶联免疫吸附测定方法研究

摘要

酶联免疫技术在农药残留检测中得到广泛应用，本课题开展了高效氟吡甲禾灵和精吡氟禾草灵酶联免疫吸附测定方法的研究，主要内容包括高效氟吡甲禾灵和精吡氟禾草灵半抗原的设计、人工抗原的合成、多克隆抗体制备和相应的ELISA检测方法的建立，同时还用优化后的ELISA法对高效氟吡甲禾灵和精吡氟禾草灵在样品中进行了添加回收检测。
　　 通过对高效氟吡甲禾灵和精吡氟禾草灵分子进行改造，以高效氟吡甲禾灵和精吡氟禾草灵水解后分别得到高效氟吡甲禾灵的半抗原GHs和精吡氟禾草灵的半抗原JHs，再分别将半抗原GHs和JHs与四氨基丁酸反应制得高效氟吡甲禾灵的接臂半抗原GHj和精吡氟禾草灵的接臂半抗原JHj。经质谱、核磁共振确证了四个半抗原的结构。采用碳二亚胺法将半抗原和牛血清蛋白(BSA)偶联制备了免疫抗原，采用混合酸酐法将半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联制备了包被抗原，经紫外光谱分析证明成功地合成了免疫和包被所需的人工抗原。用免疫原免疫新西兰大白兔后，分别获得了高效氟吡甲禾灵和精吡氟禾草灵的特异性抗血清，用辛酸-硫酸铵法分离纯化抗血清，冷冻干燥后获得两者的多克隆抗体。通过同源异源分析后，GHs-OVA作为包被原，GHs-Ab作为抗体对高效氟吡甲禾灵测定的灵敏度最高；JHs-OVA作为包被原，JHs-Ab作为抗体对精吡氟禾草灵测定的灵敏度最高。进一步研究了有机溶剂、pH值和离子强度在间接竞争ELISA法中对高效氟吡甲禾灵和精吡氟禾草灵ELISA法检测灵敏度的影响，确定了20％的甲醇含量和pH7.5和0.3mol/L的离子强度的磷酸盐缓冲溶液为高效氟吡甲禾灵和精吡氟禾草灵间接竞争酶联免疫吸附分析方法的最佳工作条件。
　　 利用筛选出来的抗体和抗原，在优化的条件下，得到了高效氟吡甲禾灵和精吡氟禾草灵的间接竞争酶联免疫吸附分析方法的标准曲线.高效氟吡甲禾灵在0.00190-0.926mg/mL的范围内保持一定的线性，线性回归方程％B/B0＝-29.765logC＋9.0044(R2＝0.9927)，IC50为0.0419mg/L，最低检测限(IC10)为0.00190mg/L。制备的抗体对其他芳氧苯氧基丙酸酯类除草剂没有明显交叉反应。精吡氟禾草灵间接竞争ELISA的回归曲线为线性回归方程％B/B0=-20.506logC+44.724(R2=0.9969),IC50为0.553mg/L，最低检测限(IC10)为0.00620mg/L，线性检测范围在0.00620-49.358mg/L。该方法有着较好的特异性，对其他芳氧苯氧基丙酸酯类除草剂没有明显的交叉反应。
　　 以建立的ic-ELISA方法进行样品的添加回收实验。对高效氟吡甲禾灵进行了水、土壤、黄瓜、甘蓝、番茄、大豆、马铃薯中的平均添加回收实验，高效氟吡甲禾灵的平均添加回收率为87.43～111.80％，变异系数为0.11～12.56％。对精吡氟禾草灵进行了水中和土壤里的添加回收实验，平均添加回收率为86.80～103.41％，变异系数为3.96～12.32％。表明本研究建立的高效氟吡甲禾灵和精吡氟禾草灵得ELISA方法符合农药残留分析的要求。
　　 本课题的研究表明，制备的高效氟吡甲禾灵和精吡氟禾草灵抗体适用于对样品中高效氟吡甲禾灵和精吡氟禾草灵农药残留进行快速检测，其灵敏性、特异性和简便性等方面较理化分析有明显优势，具有良好的实用性。

目录

文摘

英文文摘

缩略语

第一章 文献综述

1 农药残留及其检测

1.1 农药残留

1.2 农药的样品前处理技术

1.3 农药残留检测技术

2 农药免疫分析概述

2.1 免疫分析方法的分类

2.2 农药酶联免疫方法的建立

3 芳氧苯氧丙酸酯类除草剂及其酶联免疫吸附法的研究进展

3.1 芳氧苯氧丙酸酯类除草剂简介

3.2 国内外芳氧苯氧丙酸酯类除草剂酶联免疫测定法的研究进展

4 本研究的目的、方法和意义

第二章 高效氟吡甲禾灵酶联免疫吸附分析方法研究

1 概述

2 实验材料和方法

2.1 试剂与仪器

2.2 半抗原GHs的合成

2.3 半抗原GHj的合成

2.4 人工抗原的合成以及偶联结合比的测定

2.5 抗体的制备和纯化

2.6 高效氟吡甲禾灵酶联免疫分析方法的建立及条件优化

3 结果与分析

3.1 半抗原分子的结构鉴定

3.2 人工抗原偶联物结合比的测定

3.3 多克隆抗体的效价

3.4 同源与异源分析

3.5 ic-ELISA反应条件的选择

3.6 标准曲线的建立

3.7 交叉反应的测定

3.8 基质影响的结果

3.9 添加回收的测定

4．讨论

第三章 精吡氟禾草灵酶联免疫吸附分析方法研究

1 概述

2 实验材料和方法

2.1 试剂与仪器

2.2 半抗原的合成

2.3 人工抗原的合成以及偶联结合比的测定

2.4 抗体的制备和纯化

2.5 酶联免疫分析方法的建立及条件优化

3 结果与分析

3.1 半抗原分子的结构鉴定

3.2 人工抗原偶联物结合比的测定

3.3 多克隆抗体的效价

3.4 同源与异源分析

3.5 ic-ELISA反应条件的选择

3.6 标准曲线的建立

3.7 交叉反应的测定

3.8 添加回收的测定

4．讨论

4.1 半抗原的设计

4.2 ic-ELISA分析条件的影响

4.3 水样和土壤中精吡氟禾草灵的ic-ELISA分析

全文主要结论

参考文献

附录

致谢