碱蓬DREB同源基因的克隆与功能分析

摘要

干旱、高盐和低温是诸多非生物逆境中对作物危害最为严重的自然灾害，长期以来，人们都非常关注对这种非生物胁迫的研究。通常在逆境条件下，植物能感知、传递逆境胁迫信号，诱导相关功能基因的表达，在生理生化上作出适应性响应。而转录因子在植物逆境信号传递，相关功能基因的表达调控及发育阶段的调控中发挥着关键作用。AP2/EREBP类转录因子是一类调控植物发育且与植物胁迫抗性相关的转录因子，目前拟南芥和水稻中与干旱、高盐和低温相关的AP2/EREBP类转录因子研究得比较深入。其中，DREB类转录因子可能参与了生物胁迫和非生物胁迫。碱蓬长期生长在盐地环境中，具有较强的耐盐和耐干旱胁迫能力，碱蓬DREB转录因子的克隆及功能研究可有助于了解其耐盐和耐干旱胁迫的生理和分子机制，另一方面也可以通过转基因技术将其转入其他植物来提高其对非生物胁迫的抗性。
　　 本研究以盐地碱蓬为材料，根据已有的植物干旱应答元件结合蛋白保守区的氨基酸序列WGKWVAEI和YKPLHSSV，设计一对简并引物，通过RT-PCR扩增到一条长180bp的cDNA片段，继而利用RACE技术克隆了一个碱蓬DREB基因全长cDNA，命名为SsDREB。SsDREB转录因子基因的核苷酸序列分析表明，其cDNA全长为1493bp,5′端有34bp的非翻译区，3′端具有完整的polyA尾，包含一个编码364个氨基酸的完整的开放阅读框。根据核苷酸推测的氨基酸序列分析显示，所编码的蛋白具有DREB转录因子的一些典型特征：有一个典型的AP2结构域，由64个氨基酸组成，其第14位和第19位分别是缬氨酸(V)和的亮氨酸(L)。
　　 利用实时定量PCR分别分析了SsDREB基因的表达特性。实验结果表明，SsDREB基因受到高盐和干旱的诱导，对ABA和低温基本没有响应。组织表达特异性检测表明，SsDREB在叶中表达较高，在茎中的表达量最低。
　　 我们构建了植物表达载体pGADT7-Rec2-SsDREB，通过酵母单杂交试验验证碱蓬DREB蛋白的DNA结合域。将该融合表达载体转入酵母菌株Y187，在SD/-Leu-Ura-His的平板上筛选转化子，然后在SD/-His+10 mM3-AT平板上检测报告基因的表达情况。结果表明SsDREB蛋白具有DNA结合域的功能，能够特异结合DRE元件。
　　 构建植物表达载体pCAMBIA2301-SsDREB，利用农杆菌介导法转化烟草NC89;通过Kan抗性、PCR及RT-PCR筛选鉴定烟草植株，初步证明外源基因已经整合到烟草基因组中。对转基因烟草苗进行干旱、高盐抗逆性分析并且对其相关生理生化指标进行测定，结果显示转基因烟草对这些非生物胁迫的抵抗能力比对照植株强。利用半定量RT-PCR对下游抗逆相关基因的表达分析发现，lipid transferase(ltpl)(X62395)、Lea5(AFO53076)、H+-ATPase B subunit(AF220611)、H+-ATPase(X66737)的表达量显著高于非转基因植株，推测Ss DREB基因可能增强某些抗逆相关基因的表达，进而提高转基因植株的抗逆性。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

前言

第一章 文献综述

1 植物感受逆境胁迫的分子机制

1.1 植物抗渗透胁迫的调节

1.2 抗渗透胁迫中直接起作用的蛋白质

2 植物转录因子在逆境胁迫中的作用

2.1 转录因子的概念和结构

2.2 转录因子的活性调控

2.3 转录因子的逆境信号传导过程

2.4 植物转录因子的特征与种类

3 植物AP2/EREBP转录因子家族的研究

3.1 AP2/EREBP转录因子家族

3.2 AP2/EREBP转录因子的功能

3.3 DREB类转录因子及其转基因研究进展

4 研究的目的和研究内容

4.1 立题依据

4.2 技术路线

第二章 碱蓬SsDREB基因的克隆与表达分析研究

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 基因组片段的克隆

2.2 cDNA全长序列的克隆

2.3 基因组全长的克隆

2.4 Ss DREB的核苷酸序列及氨基酸序列分析

2.5 SsDREB氨基酸序列的同源性比较与系统发育分析

2.6 SsDREB蛋白的三级结构预测

2.7 SsDREB基因组织表达特异性分析

2.8 SsDREB基因在不同胁迫下的表达模式分析

3 讨论

第三章 碱蓬SsDREB基因结合活性的功能验证

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 鱼饵质粒的构建

2.2 pGADT7-Rec2-SsDREB表达载体的构建

2.3 碱蓬SsDREB蛋白与DRE元件相互作用的研究

3 讨论

第四章 碱蓬SsDREB基因的烟草转化与功能分析

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 植物表达载体的构建

2.2 含有表达载体的农杆菌PCR检测

2.3 转SsDREB基因烟草的获得

2.4 转基因阳性植株的鉴定

2.5 转基因烟草的抗旱性和耐盐性分析

2.6 转基因烟草光合参数的测定

2.7 转基因烟草的荧光参数测定

2.8 转基因烟草在逆境条件下脯氨酸含量的测定

2.9 转基因烟草在逆境条件下可溶性糖含量的测定

2.10 半定量RT-PCR法分析下游基因的表达

3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢