霍乱弧菌群体感应调控因子VqmA活性相关基因的筛选及LysR和MFS蛋白功能的研究

摘要

霍乱弧菌（V.cholerae）是一种革兰氏阴性、兼性厌氧小杆菌，是引起人类腹泻疾病霍乱的病原体。大量研究证明，霍乱弧菌的致病能力主要是由霍乱毒素（choleraetoxin，CT）和毒素共调节菌毛（toxin-coregulated pilus，TCP）引起的。霍乱弧菌毒力基因的表达受到各种环境条件的影响，如营养物浓度和种类、温度、pH、胆汁盐和群体感应信号分子。
　　 HapR是霍乱弧菌群体感应调控系统的关键调控因子，可以抑制霍乱弧菌CT和TCP表达。LuxR家族蛋白VqmA可以在低细胞浓度时诱导HapR的表达从而降低细菌的致病性。本文通过构建转座子随机突变文库的方法筛选影响VqmA活性的基因，获得七株候选的突变株，并且对突变株M1（△VC0073，SAM-依赖的甲基转移酶）做了深入的研究。研究发现该基因缺失后，VqmA无法激活报告基因的表达，并且VqmA的转录调控活性随着该基因的回复表达而恢复，VC0073是VqmA发挥活性的必须基因。VC0073编码合成的蛋白与SAM-依赖的甲基转移酶的同源性最高，在很多细菌中该酶参与一些小分子化合物的合成，VqmA激活目的基因的过程可能需要该酶合成的某类化合物的协助，但是研究发现该化合物并不存在于细菌上清液中。
　　 LysR类蛋白是一种全局性的转录调控因子，霍乱弧菌中约有40个LysR类型的蛋白。借助生物信息学工具，在霍乱弧菌中发现了五类比较特殊的LysR蛋白，这些蛋白的下游都为MFS家族蛋白。MFS家族蛋白属于多重药物转运蛋白。我们选取其中一组基因VC1617（Encoding LysR Protein）和VC1618（Encoding Multidrug Resistanceprotein）作为研究对象，研究发现VC1617缺失和过表达后霍乱弧菌可以在LB和M9培养基正常生长，VC1617并不是细菌在这两中培养基生长的必需基因，这在一定程度上也反映出了LysR蛋白生理功能的多样性。通过构建Luminescence检测质粒发现LysR不但可以抑制自身的表达而且还可以激活下游基因VC1618（MultidrugResistance Gene）的表达。Western blot试验表明VC1617缺失后霍乱弧菌毒力基因的表达并没有受到影响；虽然VC1617缺失后多重药物转运蛋白VC1618的表达量大为降低，但是突变株对一些特定药物的耐受能力并没有削弱；在毒力基因的表达量和药物的耐受能力都没有降低的情况下，突变株在小鼠体内的定殖能力也没有降低。

目录

文摘

英文文摘

文献综述

1 霍乱弧菌的治病机理

2 霍乱弧菌的群体感应

3 LysR家族蛋白和多重抗药性蛋白

参考文献

第一章 影响霍乱弧菌群体感应调控因子VqmA活性的相关基因研究

第一节 霍乱弧菌群体感应调控因子VqmA活性相关基因的筛选及鉴定

1 材料与方法

2 结果和分析

3 小结和讨论

第二节 VC0073对群体感应调控因子VqmA活性的影响

1 材料和方法

2 结果和分析

3 小结和讨论

本章小结

参考文献

第二章 LysR和MFS蛋白功能的研究

第一节 LysR和MFS蛋白之间调控方式的研究

1 材料与方法

2 结果和分析

3 小结和讨论

第二节 LysR缺失菌株生理功能的研究

1 材料与方法

2 结果和分析

3 小结和讨论

本章小结

参考文献

全文总结

附 录

致 谢