盐胁迫小麦根系内肽酶同工酶的变化及生化特性和叶片Rubisco大亚基的降解

摘要

内肽酶是细胞内一类十分重要的蛋白水解酶，它主要能水解多肽链内部的肽键而达到降解蛋白质的目的。内肽酶在植物体内分布很广泛，在植物生长的各个阶段，如在种子萌发，器官衰老以及在各种逆境胁迫过程中均发挥着重要的调控作用。目前，国内外对植物正常生长过程中内肽酶同工酶及其功能方面的研究较多，而有关逆境胁迫下植物内肽酶同工酶的变化方面研究较少，尤其少见有盐胁迫下植物根系内肽酶同工酶的变化及生化特性的研究。
　　 为了了解小麦在盐胁迫过程中蛋白质降解和内肽酶同工酶的变化等情况，本论文以小麦（Triticum aestivumL.）耐盐品种H6756为实验材料，对其根系在盐胁迫过程中的生长生理和氧化损伤的几种指标（如根长、TBARS含量、O2-产生速率等）、内肽酶同工酶的变化和其特性以及叶片中Rubisco及其大亚基的降解情况进行了研究。主要研究内容和结果如下:
　　 1、盐胁迫下小麦根系生长及其氧化伤害的变化
　　 小麦H6756幼苗在0（对照）、25、75、150、300 mmol·L-1NaCl处理下0-8 d，结果发现:25 mmol·L1NaCl处理下的小麦根长与对照无明显差异;而300 mmol·L-1NaCl胁迫下的小麦根长则与对照的差异显著，第8天时的根长仅是对照的66.2％;随着处理时间的延长和NaCl浓度的提高，75和150 mmol·L-1 NaCl处理的小麦根长与对照之间的差异也逐渐由不显著达到显著水平。不同浓度NaCl处理可以不同程度的升高小麦根系内O2-的产生速率。其中，25和75 mmol·L-1NaCl处理下小麦根系O2-的产生速率分别在处理的第8天和第6天达到最大，与对照的相比分别升高了39.2％和39.65％;150和300 mmol·L-1NaCl处理下小麦根系O2-的产生速率均在处理第二天达到最大，随后在处理的4-8天中，前者开始下降但维持在稍高于对照的水平，而300mmol·L-1NaCl处理下的小麦根系O2-的产生速率一直保持较高水平，其产生速率在处理的2-8天中一直大约是对照水平的2倍。低浓度（25、75 mmol·L-1）NaCl处理过程中小麦根系中的TBARS含量与对照的基本相同或十分接近，而高浓度（150和300mmol·L-1）NaCl处理下根系TBARS的含量在第2天开始上升，于第4天时都达到了最大值，分别比对照的增加了22.08％和44.42％，然而150 mmol·L-1NaCl处理下根系的TBARS含量呈现出先上升，6天后又逐渐降至接近对照的水平，300 mmol·L-1NaCl处理的小麦根系中TBARS含量却一直高于其他处理的水平。
　　 2、盐胁迫下小麦根系内肽酶总活力及其同工酶的变化
　　 小麦H6756幼苗在0（对照）、25、75、150、300、400和500 mmol·L-1不同NaCl浓度处理下0-8天，结果发现:在盐胁迫过程中，小麦根系总内肽酶比活力均有不同程度地上升，同时可溶性蛋白含量在不同程度上均有下降。25、75和150mmol·L-1NaCl处理的小麦根系总内肽酶比活力在8天中都略高于对照的，且随着处理时间的延长其比活力缓慢升高;300 mmol·L-1NaCl处理的0-4天过程中，根系内总内肽酶比活力随着胁迫处理时间的延长而急剧上升，随后其比活力升高的速率放缓，但继续升高到第8天时达到了对照的1.86倍;400和500 mmol·L-1NaCl处理的0-8天过程中，根系内总内肽酶比活力随着盐胁迫处理时间延长而持续急剧上升，并且一直高于同期的300mmol·L-1NaCl处理的水平。25和75 mmol·L-1NaCl处理的根系中可溶性蛋白含量变化的趋势与对照的基本相似;150mmol·L-1NaCl处理的根系中可溶性蛋白含量在第6天达到最小值，然后到第8天又上升至接近对照的水平;300mmol·L-1NaCl胁迫处理下根系中可溶性蛋白含量一直持续下降，第8天根系中的可溶性蛋白含量只有对照的34.2％。400和500 mmol·L-1NaCl处理的0-8天过程中，根系中的可溶性蛋白含量随着盐胁迫处理时间延长而持续急剧下降，并且一直低于于同期的300 mmol·L-1NaCl处理的水平。
　　 采用以明胶为底物的内肽酶梯度凝胶电泳方法，检测到盐胁迫期间小麦根系中存在五种内肽酶同工酶(RE1-5)，它们在盐胁迫过程中分别表现出不同的情况。其中，RE1仅在NaCl处理后能检测到其活力，而在对照根系中没有检测到，并且RE1的活力随着NaCl处理浓度的升高而增强;RE2的活力在NaCl处理中呈现先升后降的趋势;RE3和RE4的活力在NaCl浓度为300 mmol·L-1及以上浓度处理时明显增强;RE5的活力随着NaCl处理时间的延长以及NaCl浓度的升高呈现先增高然后降低的趋势，且它的活力在五种同工酶中是最弱的。根据上述结果，我们推测，在以上五种内肽酶同工酶中，RE1和RE2可能是与小麦H6756根系耐盐性比较密切相关的两种同工酶。研究还发现，外施适宜浓度的ABA或GA3能够通过抑制根系中因盐胁迫升高的内肽酶活力来达到减少根系蛋白质降解的目的。
　　 3、盐胁迫下小麦根系总内肽酶及两种内肽酶同工酶的生化特性
　　 根据前面试验的结果，选用300 mmol·L-1NaCl处理6d的小麦H6756全根作为实验材料，研究了根的总内肽酶以及两种与耐盐性紧密相关的内肽酶同工酶（RE1和RE2）的生化特性。研究结果如下:
　　 盐胁迫下小麦根系总内肽酶的最适pH为4;最适温度为50℃;在4～40℃处理1h后总内肽酶的比活力变化不大，维持其较高活力水平，但随着温度的再升高其比活力逐渐降低，不过在80℃处理1h总内肽酶的比活力还保持有4℃时的68.7％;金属蛋白酶抑制剂EGTA、EDTA和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对总内肽酶的抑制效果最为明显，而ATP可显著提高总内肽酶的活力。
　　 内肽酶同工酶RE2的最适pH为6，最适温度为50℃;在较宽的pH范围(pH3-10)和温度范围(20-80℃)内都表现有活力，在70℃水浴中保温1 h后仍有较高活性，因此表现出具有良好的pH和热稳定性;而RE1的最适pH为5，最适温度为40℃;活力表现的pH和温度范围分别是3-9和30-70℃;RE1对热的表现为相对不稳定，在50℃及以上水浴中保温1 h后其活性大量丧失;添加不同蛋白酶抑制剂处理后的实验结果表明，RE1和RE2均属于丝氨酸型蛋白酶，而RE2还兼属于金属蛋白酶。
　　 采用GPAGE和western blot以及蛋白酶抑制剂处理等方法，根据实验获得的740KDa左右的RE1相对分子量、RE1活力能被丝氨酸型蛋白酶抑制剂AEBSF和PMSF以及蛋白酶体特异性抑制剂MG115明显抑制以及RE1能与20S蛋白酶体抗体发生免疫印迹反应等实验结果，RE1进一步被确定为20S蛋白酶体。RE1（20S蛋白酶体）在pH5的200 mmol·L-1醋酸缓冲溶液中具有最大的酪蛋白水解活性。此外，通过GPAGE分离和western blot方法，我们还检测到根中20S蛋白酶体的含量随着NaCl处理的浓度升高和处理时间的延长而逐渐下降现象。
　　 4、盐胁迫对小麦叶片Rubisco大亚基降解的影响
　　 小麦H6756幼苗在0（对照）、25、75、150和300 mmol·L-1NaCl的不同浓度下处理8d，结果显示:与对照的相比，25和75 mmol·L-1NaCl处理对小麦H6756的生长几乎没有影响;但150和300 mmol·L-1NaCl处理均能抑制小麦H6756的生长，且随着NaCl处理浓度的升高或处理时间的延长，这种抑制作用逐渐显著。到第八天，300 mmol·L-1NaClNaCl处理的小麦幼苗只长出两片真叶，而同期对照已长出三片真叶。
　　 本研究发现，与没有盐处理的对照相比，不同盐浓度处理的0-4天中小麦第一片叶内蛋白质含量呈现迅速下降的趋势，然后于4-8天中基本维持在一个稳定的水平上;叶片内肽酶比活力在0-8天中均呈现不断升高的趋势，然而在6-8天中的升高幅度明显变小。其中，300 mmol·L-1NaCl处理的叶片中内肽酶比活力上升最快，其比活力也最高，相应叶片内可溶性蛋白质的含量表现为最低。由此可见，NaCl胁迫也可诱导叶片中内肽酶活力的升高，从而加快叶片内蛋白质的降解，使叶片中的可溶性蛋白含量降低。由此可以看出，不同盐浓度胁迫处理下第一叶片中可溶性蛋白质含量以及内肽酶比活力的变化与上述根系中可溶性蛋白质含量以及内肽酶比活力的变化情况存在相似之处。这进一步表明，小麦H6756确实具有良好的耐盐特性，小麦H6756能够通过加速小麦体内的蛋白质周转速度以抵御或适应植株外界变化了的环境。
　　 研究还发现，在叶片自然（无盐处理）生长过程中，Rubisco全酶和Rubisco大亚基(LSU)的含量也持续下降，并且能检测到相对分子量为51 kDa的LSU体内降解产物。然而，在不同盐浓度处理下的0-6天中，叶片LSU51kDa降解产物的蛋白量均呈现不断增加的趋势，至第6天达到其最大值，6天后开始明显变少;其中，150和300mmol·L-1NaCl处理下的第6天后，叶片中LSU以及51 kDa的LSU体内降解产物含量明显低于对照与其他浓度盐处理的，尤其300 mmol·L-1NaCl处理下第8天叶片中的51kDa的LSU体内降解产物已几乎检测不到;而25和75 mmol·L-1NaCl处理下叶片中Rubisco含量及LSU的降解情况则与无NaCl处理的对照基本相似。以上结果表明，相比其它处理，较高浓度(150、300 mmol·L-1) NaCl胁迫下小麦叶片中的内肽酶的活力明显升高，从而使叶片中Rubisco全酶、LSU及LSU体内降解产物降解的速度加快;而53 kDa的Rubisco大亚基一旦被降解成51 kDa产物，51 kDa产物的进一步降解的速度会大大地加快，由此推测，Rubisco大亚基N-末端的分子量大约2 kDa的一段多肽链对于稳定Rubisco的结构可能具有重要的作用。
　　 以上研究结果有助于更加全面地了解植物根系和叶片内的内肽酶（同工酶）变化和蛋白质降解的情况，为进一步深入阐明植物内肽酶与蛋白质降解的机制及其与植物耐盐性的关系提供了一定的科学依据。

目录

声明

摘要

缩略词对照表

文献综述

一、植物的耐盐性

1．盐渍土与耐盐植物的分类

2．盐渍土对植物生长的影响

3．植物的耐盐机理

二、植物内肽酶

1．蛋白水解酶的类型

2．植物衰老过程中的内肽酶

3．逆境胁迫下的植物内肽酶

三、泛素-26S蛋白酶体途径

1．泛素-26S蛋白酶体途径的组成及其功能

2．泛素-26S蛋白酶体途径的作用机理

3．泛素-26S蛋白酶体途径在植物生长发育过程中的作用

四、植物体内的Rubisco

1．植物中Rubisco的结构

2．植物中Rubisco的降解

第一章 不同浓度NaCl处理对小麦H6756幼苗根系生长及氧化伤害的影响

1．材料与方法

1．1 材料与处理

1．2 主根长的测定

1．3 根内超氧阴离子(O2·ˉ)产生速率的测定

1．4 根内硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)含量的测定

2．结果与分析

2．1 不同浓度NaCl处理过程中小麦H6756根生长的差异

2．2 不同浓度NaCl处理过程中小麦H6756根内超氧阴离子(O2·ˉ)产生速率的变化

2．3 不同浓度NaCl处理过程中小麦H6756根内硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)含量的变化

3．讨论

第二章 不同浓度NaCl以及外源ABA或GA3处理对小麦H6756根系内肽酶变化的影响

1．材料与方法

1．1 材料与处理

1．2 方法

2．结果与分析

2．1 低和中高浓度盐胁迫下小麦H6756根系可溶性蛋白含量和总内肽酶活力以及同工酶的变化

2．2 高浓度盐胁迫下小麦H6756根系可溶性蛋白含量和总内肽酶活力以及同工酶的变化

2．3 ABA或GA3对300 mmol·L-1NaCl胁迫下小麦H6756根系可溶性蛋白质含量和总内肽酶活力的影响

3．讨论

第三章 盐胁迫下小麦根系中内肽酶及其中二种内肽酶同工酶的生化特性分析与鉴定

1．材料与方法

1．1 材料与处理

1．2 方法

2．结果与分析

2．1 小麦根系总内肽酶的生化特性

2．2 小麦根系内肽酶同工酶RE1和RE2的生化特性

2．3 内肽酶同工酶RE1的鉴定

2．4 不同缓冲材料对内肽酶同工酶RE1活力的影响

2．5 不同浓度盐处理对小麦H6756根系中20S蛋白酶体含量的影响

3．讨论

第四章 不同浓度NaCl处理对小麦H6756叶片Rubisco大亚基降解的影响

1．材料与方法

1．1 材料与处理

1．2 方法

2．结果与分析

2．1 不同浓度盐胁迫下小麦H6756地上部分生长情况

2．2 不同浓度盐胁迫下小麦H6756叶片中可溶性蛋白含量和总内肽酶比活力的变化

2．3 不同浓度盐胁迫下小麦H6756叶片中Rubisco含量和大亚基降解的变化

2．4 Rubisco大亚基体内降解产物的鉴定

3．讨论

全文主要结论

论文创新之处

问题及研究工作展望

参考文献

攻读学位期间发表(待发表)的研究论文

致谢