F2代筛选法检测新疆棉铃虫田间种群Cry1Ac抗性基因频率

摘要

棉铃虫Helicovcrpa armigera Hübner属鳞翅目夜蛾科，是一种世界性的农业害虫。20世纪90年代初，由于棉铃虫抗药性水平突增，导致棉铃虫大面积暴发，并造成了严重的经济损失。Bt棉由于对靶标害虫具有优异防治效果，在全球广泛种植，有效地控制了棉铃虫为害。Bt棉在整个生长发育时期都表达Bt毒素蛋白(Cry1Ac)，对靶标害虫形成巨大选择压力，靶标害虫对Bt棉抗性的演化将成为影响Bt棉使用寿命的限制因素。
　　 Bt棉在中国黄河和长江流域棉区已广泛种植多年，Bt棉占棉花总面积90％左右;但在新疆棉区种植面积有限，Bt棉占棉花总面积10％左右。有关黄河流域和长江流域棉区棉铃虫田间种群Cry1Ac抗性基因频率的检测，已有相关报道;但新疆棉区棉铃虫Cry1Ac抗性基因频率还没有报道。本研究采用F2代筛选法检测了2个新疆棉铃虫田间种群Cry1Ac抗性基因频率，筛选获得2个棉铃虫Cry1Ac抗性品系，并测定了这2个抗性品系的抗性谱、抗性遗传方式和钙粘蛋白cDNA全长序列。
　　 1.新疆棉铃虫田间种群Cry1Ac抗性等位基因频率的估算
　　 采用F2代筛选法检测了2010年采自南疆莎车种群和北疆沙湾棉铃虫种群对Bt毒素Cry1Ac的抗性基因频率。对莎车种群，共筛选了151个单雌系F2后代，其中5个为阳性;对沙湾种群，共筛选了113个单雌系F2后代，其中3个为阳性。经检测和估算，2010年南疆莎车种群和北疆沙湾种群棉铃虫对Cry1Ac的抗性等位基因频率分别为:0.0098和0.0108。
　　 2.田间棉铃虫抗性品系抗性谱与抗性遗传方式
　　 对F2代筛选获得的阳性单雌系后代用Cry1Ac连续筛选2代，从南疆莎车和北疆沙湾棉铃虫种群中各获得一个抗性品系:SC23和SW34。毒力测定表明，SC23和SW34品系对Cry1Ac活化毒素的抗性倍数分别为22和20倍。SC23抗性品系对Cry1Aa和Cry1Ab分别具有27和20倍的交互抗性，SW34对Cry1Aa和Cry1Ab都具有17倍的交互抗性，两个品系对Cry2Ab均无交互抗性。通过测定抗性品系与敏感品系(SCD)正反交F1种群对Cry1Ac的LC50，结果表明SC23对Cry1Ac抗性为常染色体、不完全隐性遗传，SW34对Cry1Ac抗性为常染色体、不完全显性遗传。
　　 3.棉铃虫SC23和SW34抗性品系钙粘蛋白基因的鉴定
　　 将SC23和SW34抗性品系分别与SCD-r1（钙粘蛋白基因r1突变纯合品系）、SCD（敏感品系）进行杂交，根据其F1后代对Cry1Ac的敏感性判断抗性等位基因遗传互补情况。SC23和SW34品系在钙粘蛋白位点与敏感品系表现为遗传互补，而与SCD-r1品系不能遗传互补;该结果表明SC23和SW34抗性品系对Cry1Ac的抗性均与钙粘蛋白等位基因的变异相关。因此，对这两个抗性品系的钙粘蛋白基因全长cDNA进行了克隆和测序。结果发现SC23和SW34钙粘蛋白基因编码的氨基酸序列与敏感品系相比长度不变，氨基酸序列存在多个多态性位点。因此，SC23和SW34抗性品系的钙粘蛋白可能通过氨基酸替换导致对Cry1Ac产生抗性。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 Bt毒素

1．1 Bt毒素的来源与分类命名

1．2 Bt毒素的结构

1．3 Bt毒素的杀虫活性

2 Bt毒素的作用机理

2．1 作用机理

2．2 毒素在昆虫体内的结合受体

3 害虫Bt抗性的检测方法

3．1 传统剂量反应法(Dose-response bioassay)

3．2 区分剂量法(Diagnostic dose bioassay)

3．3 F1代筛选法(F1 screen)

3．4 F2代筛选法(F2 screen)

3．5 抗性基因分子检测法(Molecular detection of resistant genes)

4 害虫的抗性遗传方式

4．1 害虫对Bt抗性的显性水平

4．2 抗性是否为性连锁遗传或是否具有母体效应

4．3 抗性涉及的基因数目

5 抗性治理策略

5．1 高剂量／庇护所

5．2 基因策略

5．3 抗性监测

6 本研究的目的及意义

第二章 棉铃虫田间种群Cry1Ac抗性基因频率的估算

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 单雌系F2代原理

1．3 试验方法

1．4 抗性等位基因频率的计算方法

2 结果与分析

2．1 南疆莎车县田间棉铃虫种群抗性基因频率检测结果

2．2 北疆沙湾县田间棉铃虫种群抗性基因频率监测结果

3 讨论

第三章 田间棉铃虫抗性品系抗性谱和抗性遗传方式及钙粘蛋白突变的鉴定

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2 抗性遗传方式的研究

3 棉铃虫钙粘蛋白cDNA全长的克隆

3．1 中肠总RNA的提取

3．2 RNA质量的检测

3．3 基因组DNA的提取

3．4 PCR引物设计

3．5 PCR反应

3．6 PCR产物的回收纯化、克隆及序列测定

4 结果和分析

4．1 抗性品系的纯化及抗性遗传方式与抗性谱

4．2 南疆SC23钙粘蛋白基因cDNA的克隆及序列比对

4．3 北疆SW34钙粘蛋白基因cDNA的克隆及序列比对

5 讨论

全文总结

参考文献

致谢