卡介菌多糖核酸免疫增强作用与安全性研究及其脂质体的制备与评价

摘要

卡介菌多糖核酸（Bacillus Calmette Guerin polysaccharide nucleic acid，BCG-PSN）是一种新型免疫调节剂，具有提高T淋巴细胞免疫功能;激活T淋巴细胞，促进白细胞介素等分泌，从而产生多种免疫调节的淋巴因子;增强巨噬细胞功能，提高机体杀伤细菌、病毒能力;提高溶菌酶活力等众多作用。经临床试验证实，BCG-PSN目前已成为防治哮喘、慢性支气管炎、风湿性关节炎、神经性皮炎等病症较为理想的药物。为进一步提高BCG-PSN的疗效并减少其不良反应，我们在本试验中采用独特的低温细菌细胞破壁、热酚提取法分离和提纯BCG-PSN，并设计了适合本药物的的薄膜蒸发法制备BCG-PSN脂质体。同时为了提高药物稳定性，制备了BCG-PSN冻干脂质体。在此基础上，我们对BCG-PSN免疫增强作用及其安全性进行评价，为BCG-PSN在畜牧养殖业中的应用提供试验和理论依据。
　　 1.BCG-PSN制备条件的优化及其质量控制为了优化BCG-PSN制备工艺，试验采用超声破碎卡介菌(BCG)的细胞壁，利用热酚法除去菌体蛋白，以多糖核酸的含量为考察指标，选取苯酚浓度、热酚次数、乙醇用量三个因素，每个因素三个水平，通过正交试验L9(33)确定BCG-PSN的最佳提取工艺和条件。结果表明，对BCG-PSN提取量影响因素的大小依次是热酚次数、苯酚浓度、乙醇用量，并且90％苯酚、热酚处理次数为4次、浓缩液∶乙醇为1∶5时，所获得的BCG-PSN含量最大(96.488％)，而且对上述最佳工艺进行了重复性验证，证实其具有良好的重现性。
　　 2.BCG-PSN与IBD疫苗联合应用对鸡的免疫增强作用将0.6 mg·kg-1，0.3mg·kg-1，0.15 mg·kg-1，0.075 mg·kg-1和0.0375 mg·kg-1的BCG-PSN与IBD疫苗联合应用于人工感染IBDV的受试雏鸡，通过测定免疫器官指数、IBD抗体滴度、外周血T淋巴细胞亚群、巨噬细胞吞噬活性、血清IFN-γ及IL-2浓度等免疫学指标，研究BCG-PSN和IBD疫苗的免疫协同作用及其效果。研究结果表明，与单用IBD疫苗比较，高剂量BCG-PSN(0.6 mg·kg-1)能够极显著地升高脾脏和胸腺系数，中剂量(0.15mg·kg-1)、低剂量(0.075 mg·kg-1) BCG-PSN能极显著延缓法氏囊退化;中剂量(0.15mg·kg-1)的BCG-PSN能够明显诱导IBD抗体的产生和提高CD4+/CD8+T淋巴细胞比值，维持CD4+和CD8+T淋巴细胞的平衡;BCG-PSN显著升高鸡血清IFN-γ和IL-2含量，而且作用持续时间相对较长，尤其对IL-2的持续诱导效果更为明显。说明与IBD疫苗联合应用，BCG-PSN能够剂量相关性的促进鸡机体产生相应抗体，同时增强机体体液免疫和细胞免疫作用;BCG-PSN对非特异性免疫没有明显影响。
　　 3.BCG-PSN安全性观察BCG-PSN的静脉刺激性、溶血及过敏反应。以药物最大溶解度为最高剂量，小鼠分别腹腔注射不同剂量的BCG-PSN，测定其急性毒性;小鼠腹腔注射不同剂量的BCG-PSN，连续给药14 d，观察其亚慢性毒性;小鼠腹腔注射不同剂量的BCG-PSN，以小鼠骨髓微核扣精子畸形为指标，评价其致突变作用。结果表明，BCG-PSN无静脉刺激性、溶血及过敏反应。腹腔注射不同剂量的BCG-PSN，最高剂量2000 mg·kg-1·bw-1，连续观察14d，小鼠仅出现轻微的中毒症状，未出现死亡，故小鼠腹腔注射BCG-PSN的最大给药量为2000 mg·kg-1·bw-1;与正常对照组比较，亚慢性毒性试验小鼠在整个试验周期内反应灵敏、活动正常且未出现死亡;BCG-PSN高、中剂量组小鼠进食量在前期显著降低，高剂量组小鼠体重在试验前期显著下降;高剂量组脾脏指数显著升高，高、中剂量组白细胞总数、红细胞总数、血红蛋白、红细胞压积和平均红细胞容积显著降低，尿素氮显著升高，高剂量组白蛋白显著降低。其他各项指标及病理组织学检查结果与正常对照组没有显著性差异。小鼠致畸初步试验结果表明，BCG-PSN对骨髓微核和精子畸形试验结果均为阴性。试验证实，小鼠腹腔注射BCG-PSN的最大给药量为2000 mg·kg-1·bw-1，长期大剂量应用BCG-PSN可能引起贫血，无致突变作用。
　　 4.BCG-PSN脂质体的制备根据水溶解性药物的特点，本论文选用经典的薄膜蒸发法制备BCG-PSN脂质体（附图），并采用星点设计-归一化法优化普通BCG-PSN脂质体(FBL)的处方。在单因素考察的基础上，确定三个自变量为BCG-PSN/卵磷脂（％，w/w）、胆固醇/卵磷脂(％，w/w)以及BCG-PSN加入量(mg);因变量为包封率(％)、回收率(％)、粒径与5000nm的差以及径距。研究结果表明，以优化处方制备样品，各指标实测值与预测值偏差较小。
　　 5.BCG-PSN冻干脂质体的制备及其稳定性本试验通过正交试验得到最佳处方，确定BCG-PSN冻干脂质体(PBL)的最佳参数。在此基础上，对修饰前后BCG-PSN脂质体的性质及其在光照、分散介质、模拟生物环境以及长期放置稳定性进行了研究，并同时以BCG-PSN注射液作为对照。结果显示，BCG-PSN冻干脂质体体外稳定性较普通BCG-PSN脂质体更强。

目录

声明

论文说明

摘要

第一篇 文献综述

1 多糖类药物概述

2 核酸类药物概述

3 免疫佐剂概述

4 卡介菌多糖核酸概述

5 脂质体给药系统

参考文献

第二篇 试验研究

第一章 卡介菌多糖核酸的制备及其制备条件的优化

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 BCG-PSN与IBD疫苗联合应用对鸡免疫增强作用研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 BCG-PSN安全性初步评价

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四章 BCG-PSN脂质体的制备及理化特性研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第五章 BCG-PSN冻干脂质体的制备及其稳定性研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

论文创新点

致谢

论文发表情况