奶牛乳腺组织miRNAs表达谱及基因BOLA-DQA2剪接体相关miRNAs分析

摘要

乳腺炎是现代奶牛业中一种常见的、复杂的炎症性疾病，可造成重大的经济损失。它受遗传、环境等多种因素的影响，在其发生过程中有多种免疫相关基因参与。迄今为止，有关乳腺炎抗性分子机制尚不明了，特别是抗性相关基因的表达调控机制还不清楚。MicroRNA(miRNA)是一类长约22nt的内源性、非编码RNAs，它可负调控基因转录后的表达，在免疫反应过程中有着重要作用;可变剪接(alternative splicing，AS)是在基因转录后水平上对基因的一种调控机制，对基因生物功能的发挥有调控作用。为了探索在乳腺炎发生过程中，miRNA和可变剪接对免疫相关基因BOLA-DQA2的调控机制，以期了解乳腺炎的发病机理，丰富对奶牛乳腺炎抗性的认识。本文初步研究了miRNAs和可变剪接体与乳腺炎的关系。本论文分以下三部分:一奶牛乳腺组织miRNAs表达谱分析
　　 在真核细胞中，miRNA对基因表达调控具有重要作用。近年来，已在哺乳动物中发现了许多的miRNAs。为了扩展miRNA数量和分析乳腺组织miRNA表达与乳腺炎的潜在关系，本实验采用Solexa测序方法检测了患乳腺炎奶牛的乳腺组织miRNAs的表达谱，然后利用生物信息学的方法注释miRNAs序列，结果共检测出375个miRNAs序列，其中230个miRNAs为miRNA数据库中已知的，145个为新miRNAs;鉴定出了1个新mirton和1个双向转录miRNA。新发现的miRNAs可能为乳腺炎组织特异性表达的，可能在奶牛乳腺炎发生的过程中起着重要的作用。本研究丰富了牛miRNAs数据库，这些结果将促进哺乳动物基因组的功能注释和miRNAs功能与比较基因组学的研究。
　　 二奶牛BOLA-DQA2基因可变剪接体与功能性SNPs的鉴定
　　 主要组织相容性复合体二类基因（MHC，major histocompatibility complex）在牛上也叫BOLA-DQA2，它参与免疫应答反应。为了探讨BOLA-DQA2基因变异与奶牛乳腺炎抗性的关系，通过RT-PCR、克隆测序及序列比对的方法，在奶牛乳腺组织鉴定出两种BOLA-DQA2基因剪接体。其中，一种剪接体与NCBI参考序列一致，命名为BOLA-DQA2-complete;新的剪接体命名为BOLA-DQA2-SV1。剪接体BOLA-DQA2-SV1在exon3缺少195bp、在3'-UTR区缺少52bp和167bp。BOLA-DQA2-SV1通过提前引入终止密码子，编码了一个潜在的含有255个氨基酸的蛋白质。序列比对还鉴定出13个新的单核苷酸多态性(SNPs)和多核苷酸多态性（MLNPs），其中4个SNPs和MLNPs导致蛋白潜在的保守区的氨基酸突变，且一个SNP(c.+1283C＞T)发生在bta-miR-2318种子序列区结合的区域，可能会影响bta-miR-2318与靶基因的结合。两种剪接体在健康和患乳腺炎奶牛的乳腺组织中均有表达。在健康和患乳腺炎奶牛的乳腺组织中，BOLA-DQA2-SV1的表达量均显著高于BOLA-DQA2-complete的表达量，表明BOLA-DQA2-SV1是BOLA-DQA2基因的主转录本。BOLA-DQA2-SV1在患乳腺炎奶牛乳腺中的表达量呈2.67倍上调(p＜0.05)。上述结果提示，BOLA-DQA2-SV1可能在奶牛乳腺炎抗性方面扮演着重要的角色，而SNPs是否会影响BOLA-DQA2基因的结构以及它们与奶牛乳腺炎的关系还需做进一步研究。
　　 三 BOLA-DQA2基因不同剪接体靶标miRNAs的表达分析
　　 应用靶标miRNA预测软件分析了与BOLA-DQA2基因两种剪接体的3'-UTR结合的miRNAs，并利用茎环-荧光定量PCR(Stem-loop-Q-PCR)分析了5个候选靶miRNAs在健康(n=5)和患乳腺炎奶牛(n=5)乳腺组织中的表达。预测结果显示，靶向BOLA-DQA2-SV1基因的miRNAs数量比BOLA-DQA2-complete少;荧光定量结果表明，在患乳腺炎奶牛的乳腺组织中，5个潜在靶向BOLA-DQA2两个转录本的miRNAs中，除了bta-miRNA-1777a之外，bta-miR-296、bta-miR-2430和bta-miR-671的表达量分别上调1.75、2.59和1.92倍(p＜0.05)，而bta-miRNA-2318下调1.43倍(p＜0.05)。乳腺miRNAs差异表达的结果与靶基因BOLA-DQA2剪接体的差异表达结果相吻合，提示miRNA可能对BOLA-DQA2基因有重要的调节作用，但还需进一步研究。

目录

声明

摘要

英文缩写

文献综述

1 奶牛乳腺炎发病原因、危害与免疫

1．1 奶牛乳腺炎的发病原因

1．2 奶牛乳腺炎与免疫

1．3 奶牛乳腺炎的危害

2 miRNA与免疫反应

2．1 miRNA-16对炎症的基本调控

2．2 miRNA-146a对先天性免疫反应的负调控

2．3 miRNA-181a对B细胞分化与CD4+T细胞激活的调控

2．4 miRNA-223对中性粒细胞增殖与激活的调控

3 可变剪接体与免疫反应

3．1 可变剪接体的基本模式

3．2 可变剪接的调节机制

3．3 可变剪接体对免疫功能的影响

4 BOLA-DQA2基因与免疫

5 基因研究中应用技术概述

6 本研究目的和意义

参考文献

试验1 奶牛乳腺组织miRNAs表达谱分析

1 材料与方法

1．1 乳腺组织样品的获取及总RNA的提取

1．2 Solexa测序

1．3 生物信息学分析

2 结果与讨论

2．1 总RNA的质量鉴定

2．2 小RNA的分类注释

2．3 miRNAs的鉴定与表达谱分析

2．4 与免疫有关miRNAs的表达分析

2．5 双向转录(Bidirectionaly transcribed)miRNA

2．6 mirtron的鉴定

3 本章结论

参考文献

试验2 奶牛BOLA-DQA2基因可变剪接体与功能性SNPs的鉴定

1 试验材料与方法

1．1 试验动物的选择

1．2 组织样品总RNA的提取和cDNA的合成

1．3 实时荧光定量PCR(q-PCR)

1．4 数据统计

2 结果与分析

2．1 BOLA-DQA2基因剪接体的鉴定

2．2 健康与患乳腺炎奶牛BOLA-DQA2基因剪接体的表达量分析

2．3 BOLA-DQA2基因的CDS与UTR区SNPs的鉴定

3 讨论

3．1 BOLA-DQA2基因剪接体的鉴定与表达量分析

3．2 SNPs对外显子剪接增强子元件的影响

4 本章结论

参考文献

试验3 奶牛BOLA-DQA2基因不同剪接体靶标miRNAs的表达分析

1 材料与方法

1．1 试验动物的选择

1．2 试验方法

1．3 乳腺组织中总RNA的提取及cDNA的合成

1．4 miRNAs的定量

1．5 统计分析

2 结果与分析

2．1 BOLA-DQA2基因两种剪接体的靶标miRNAs

2．2 乳腺组织靶标miRNAs表达量分析

3 讨论

4 本章结论

参考文献

全文结论

附录

致谢

作者简介