Kisspeptin-10对鹌鹑产蛋启动及肝脏脂代谢的影响研究

摘要

Kisspeptin-10，-14和-13为kisspeptin-54的裂解产物，由Kiss-1基因编码，均是G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor, GPR54)的内源性配体。不同物种间，kisspeptin-10的氨基酸序列高度保守。然而，迄今有关Kisspeptin对禽类生殖活动的影响研究较少，仅见两篇文献报道。已有资料显示，鸭下丘脑存在kisspeptin的阳性表达，且具有调节生殖轴下丘脑-垂体-性腺轴（hypothalamus-pituitary-gonads，HPG）激素分泌的功能。雌激素是卵巢分泌的甾体类激素，可反馈调节生殖轴的分泌活动，在外周可直接促进血脂和脂肪酸合成关键酶基因表达。禽类产蛋过程也是能量的富集过程，脂质含量占禽蛋重的10％。肝脏是禽类脂代谢的主要器官。因此，本试验结合体内、体外研究方法，探讨kisspeptin对禽类开产过程中脂代谢的影响及可能机制。
　　 1、Kisspeptin-10对雌鹌鹑肝脏脂代谢的影响及机制研究本实验选用75羽22日龄雌鹌鹑，随机分为三组，每组5个重复，每个重复5只:腹腔注射300μL生理盐水组（对照组，Con），注射0.1nmol kisspeptin-10(低剂量组，L)和1 nmol kisspeptin-10组（高剂量组，H），每日注射一次，连续注射3周。记录鹌鹑开产情况并于60日龄时采集血液和肝脏组织，用放射性免疫方法检测血清中雌二醇（estradiol，E2）含量;用生化分析法测定血清中总胆固醇(total cholesterol，Tch)、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C）、游离脂肪酸（non-esterified fatty acid, NEFA）、葡萄糖(glucose)、载脂蛋白B(apoprotein B，ApoB)和A1(apoprotein A1，ApoA1)以及肝脏中TG、Tch、HDL-C和LDL-C的含量。采用实时荧光定量RT-PCR方法检测肝脏中以下关键因子和酶的基因表达水平:固醇调节元件结合蛋白1（sterol regulatory element-binding proteins1，SREBP-1）、固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2)、脂肪酸合成酶（fatty acid synthestase，FAS）、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylaseα，ACCα)、硬脂酰辅酶A脱氢酶(stearylcoenzyme A dehydrogenase1，SCD1)、苹果酸酶(malic enzyme，ME)、3-羟-3-甲基戊二酸单酰CoA还原酶（3-hydroxyl-3-methyl glutaryl-coenzyme A reductases，HMGCR）和胆固醇7α-羟化酶(cholesterol7α-hydroxylase，CYP7A1)、载脂蛋白:ApoVLDL-Ⅱ、ApoB、ApoA1;脂肪酸结合蛋白2（fatty acid binding protein2，FABP2）及卵黄蛋白原-Ⅱ(vitellogenin-Ⅱ，VTG-Ⅱ)、雌激素受体α(estrogen receptorα，ERα)、β（estrogenreceptorβ，ERβ）mRNA，以及以SREBP-1为靶的microRNAs（miRNAs）的表达水平;并采用western blot方法检测SREBP-1、SREBP-2和ERα蛋白水平。结果表明:与对照组相比，L组和H组鹌鹑产蛋率分别显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)升高;注射kisspeptinp-10增加血液E2浓度，且于高剂量时达统计显著水平(P＜0.05);H组鹌鹑血清Tch和HDL-C浓度显著降低(P＜0.05)，肝脏TG和Tch含量分别极显著(P＜0.01)和显著增加(P＜0.05);H组鹌鹑肝脏SREBP-1、FAS、ApoVLDL-Ⅱ mRNA表达显著增加（P＜0.05）、VTG-Ⅱ和CYP7A1 mRNA表达极显著增加（P＜0.01），其他基因表达水平没有显著变化(P＞0.05);肝脏SREBP-1和ERα蛋白表达分别极显著（P＜0.01）和显著(P＜0.05)增加，而SREBP-2蛋白表达各组间没有显著差异(P＞0.05)。以上结果提示:产蛋前连续注射kisspeptin-10可显著提高鹌鹑产蛋率、增加雌激素的分泌、增强肝脏脂合成及沉积到卵巢中的能力，这可能与kisspeptin-10上调相关酶和因子的表达有关。
　　 2、kisspeptin-10对鸡胚肝细胞脂代谢的影响及其作用机制选取14胚龄海兰蛋鸡鸡胚，分离纯化肝细胞，有血清培养基培养1d后采用无血清培养基（0.1％胰岛素-转铁蛋白-硒，insulin-transferrin-Se，ITS）培养。在无血清培养基稳定24 h后，用Kisspeptin-10(Kp-10)处理细胞，24 h后，收集细胞上清及细胞，分别检测细胞活力（MTT法）和细胞中TG、Tch、HDL-C和LDL-C含量;细胞中脂代谢相关因子和酶的转录水平，包括:FAS、ACCα、SCD-1、肉毒碱棕榈酰基转移酶(carnitine palmityl transferase1,CPTl)、ME、SREBP-1、SREBP-2、HMGCR、ApoVLDL-Ⅱ、ApoB、ApoA1和FABP2基因，以及以SREBP-1为靶的miRNAs的表达水平表达水平;western blot方法检测细胞中SREBP-1蛋白表达水平。结果显示:1、100和1000 nM Kp-10处理对无血清培养的肝细胞活力无显著影响，100 nM时可显著促进TG、HDL-C、LDL-C的合成(P＜0.05)。2、在100 nM Kp-10处理下，SREBP-1和ACCα mRNA表达显著降低（P＜0.05）;SCD-1 mRNA表达极显著下调（P＜0.01）;FAS和ApoA1基因表达具有降低的趋势（P=0.08和0.075），而ApoVLDL-Ⅱ基因表达呈上调趋势(P=0.072)，对其他基因表达没有显著影响(P＞0.05)。3、100nM Kp-10处理显著上调SREBP-1蛋白水平(P＜0.05)。以上结果提示:Kp-10促进体外培养的鸡胚肝细胞脂合成可能与脂合成过程中的相关酶的活性和SREBP-1蛋白的表达增加有关。

目录

声明

摘要

本文部分缩写的英文对照

引言

第一章 禽类生殖启动与脂代谢

1．禽类脂代谢特点

1．1 禽类脂肪吸收

1．2 禽类脂肪的合成

1．3 禽类脂肪的分解

1．4 禽类脂肪的转运

2．生殖启动与脂代谢

2．1 生殖启动的机理

2．2 生殖启动过程中脂代谢的变化

第二章 Kisspeptin-10对生殖启动的调节

1 生殖轴

2 卵黄蛋白原的启动调控

3 Kisspeptin-10在生殖启动中的作用

3．1 Kisspeptin／GPR54系统

3．2 kisspeptin／GPR54信号系统在生殖启动中的作用

4 生殖启动过程中脂代谢的调控

4．1 肝脏脂代谢关键因子及其调控

4．2 生殖激素对脂代谢的调节

第三章 Kisspeptin-10对鹌鹑产蛋启动及脂代谢的影响及其机理探索

1 材料与方法

1．1 实验动物及处理

1．2 主要试剂和仪器

1．3 主要溶液

1．4 血清和肝脏中Tch、HDL-C和LDL-C的提取与检测

1．5 雌二醇含量测定

1．6 Real-time RT PCR检测鹌鹑肝脏中脂代谢关键点相关基因表达

1．7 Western blot方法检测鹌鹑肝脏中SREBP-1、SREBP-2和ER α蛋白表达水平

1．8 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 Kp-10对鹌鹑产蛋率的影响

2．2 Kp-10对鹌鹑血清中E2浓度的影响

2．3 Kp-10对鹌鹑血脂和肝脂浓度的影响

2．4 Kp-10对鹌鹑肝脏中脂代谢相关因子和酶mRNA表达的影响

2．5 Kp-10对肝脏中以SREBP-1为靶的miRNAs表达的影响

2．6 肝脂含量与脂代谢相关基因mRNA表达间的相关性分析

2．7 Kp-10对鹌鹑肝脏中雌激素受体α、βmRNA表达的影响

2．8 Kp-10对鹌鹑肝脏中VTG-Ⅱ mRNA表达的影响

2．9 Kp-10对鹌鹑肝脏中SREBP-1、SREBP-2和ERα蛋白表达的影响

3 讨论

第四章 Kisspeptin-10对体外培养鸡胚肝细胞脂代谢的影响及其作用机制

1 材料与方法

1．1．实验动物

1．2 主要试剂和仪器

1．3 主要溶液配制

1．4 鸡胚肝细胞分离

1．5 肝细胞的培养与处理

1．6 MTT法检测细胞活力

1．7 Real-time RT PCR检测肝细胞中脂代谢关键点相关基因表达

1．8 Western blot方法检测鸡胚肝细胞中SREBP-1蛋白表达水平

1．9 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 鸡胚肝细胞原代培养形态学观察

2．2 Kp-10处理对肝细胞相对活力的影响

2．3 Kp-10处理对鸡胚肝细胞TG、Tch、HDL-C和LDL-C含量的影响

2．4 Kp-10处理对鸡胚肝细胞脂代谢相关因子和酶基因表达的影响

2．5 Kp-10处理对鸡胚肝细胞中SREBP-1蛋白表达的影响

2．6 Kp-10处理对鸡胚肝细胞中以SREPB-1为靶的miRNAs表达的影响

2．7 鸡胚肝细胞中脂代谢相关基因表达的相关性分析

3 讨论

参考文献

全文结论

致谢

攻读硕士研究生学位期间发表的学术论文情况