大豆腺苷酸激酶基因GmADK的克隆、载体构建与大豆遗传转化

摘要

腺苷酸代谢是初生代谢的重要组成部分，腺苷酸类化合物的含量变化被认为是影响细胞能量代谢的主要因素之一。腺苷酸激酶(adenylate kinase，ADK，EC.2.7.4.3)催化ATP和AMP合成两分子ADP的可逆反应，是生成ADP和平衡腺苷磷酸类化合物代谢的关键酶，是调控腺苷酸库容大小的靶标分子，其表达量直接影响腺苷酸在核甘酸代谢库和细胞代谢库中的分配。曾有研究表明，通过反义ADK基因表达载体转化马铃薯，降低了ADK的活性，导致转基因马铃薯块茎中腺苷酸含量增加，使块茎产量增加了39％，增产效果极其显著。另一些研究表明，ADK可能与植物对盐、旱等非生物胁迫的耐性有关。目前，关于大豆中的ADK方面的研究还未见报道。
　　 大豆遗传转化是大豆分子育种、种质资源创新和基因功能研究的重要手段。农杆菌介导转化法具有拷贝数低、遗传稳定、基因沉默现象少和成本低等优势，但其转化周期长、转化效率低、嵌合体比率高等问题仍未彻底解决。
　　 本研究依据大豆改良中心提供的大豆耐盐主效QTL定位信息，经过基因组学分析查询到位于该区间的候选基因腺苷酸代谢途径的关键酶——腺苷酸激酶。根据大豆数据库中基因的编码序列设计特异引物，克隆得到GmADK基因，并应用生物信息学手段分析GmADK基因及其蛋白的特性，构建了植物过表达载体和RNA干扰载体，并对大豆进行了遗传转化。具体如下:
　　 通过RT-PCR方法从大豆品种“南农1138-2”中克隆得到大豆腺苷酸激酶基因(GmADK)，使用Gateway方法构建了植物过表达载体和RNA干扰载体，并进行了生物信息学分析。结果表明:克隆得到的GmADK编码序列为801 bp，编码由267个氨基酸残基构成的多肽。预测其亚细胞结构定位于质体，具有典型的腺苷酸激酶蛋白功能域ATP-AMP(Ap5A)结合位点和AMP结合位点，蛋白质三维模型具有典型的ADK蛋白立体结构。将构建好的载体分别导入根癌农杆菌菌株EHA105，获得了工程菌菌株，并对不同的大豆品种进行转化，以验证GmADK基因的功能。
　　 同时，为了优化农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系，本研究以不同基因型大豆的子叶节外植体为研究对象，分别以bar和hyg为筛选标记基因，gus为报告基因，进行了大豆遗传转化实验。通过对转化过程中各个影响因素的研究，在转化实验过程中实施了一系列优化措施，旨在通过提高丛生芽的诱导效率、农杆菌侵染效率等，进一步提高大豆再生效率和转化效率，建立一种稳定性好、转化效率高的大豆遗传转化体系，为今后的大豆分子育种和基因功能研究打下了良好的基础。结果表明:不同基因型的最适氯气灭菌时间不同，对筛选标记的敏感性也不同;萌发培养基采用1/2MS较好;不同的切取方式导致丛生芽的再生率不同;农杆菌侵染液浓度OD600值为0.6，侵染时间30 min，共培养培养基pH值5.4，共培养时间5d时大豆子叶节丛生芽诱导率最高，侵染效果最好。

目录

声明

摘要

缩写词表

第一章 文献综述

1 腺苷与腺苷酸激酶

1．1 腺苷酸激酶ADK

1．2 RNAi技术及作用机制

1．3 大豆遗传转化体系的研究进展

1．4 论文的主要研究意义和内容

1．5 主要研究方案

第二章 大豆腺苷酸激酶基因GmADK的克隆、载体构建与生物信息学分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法与过程

2 结果与讨论

2．1 GmADK基因的表达分析

2．2 大豆腺苷酸激酶基因GmADK的克隆

2．3 表达载体的构建与鉴定

2．4 生物信息学分析

3 讨论

3．1 大豆总RNA的提取

3．2 大豆GmADK基因的克隆与表达分析

3．3 大豆GmADK基因的生物信息学分析

第三章 农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法与过程

2 结果与分析

2．1 灭菌时间对不同基因型萌发率的影响

2．2 萌发培养基对不同基因型萌发时间的影响

2．3 外植体的切取方式对丛生芽生长的影响

2．4 农杆菌EH105的生长曲线

2．5 共培养培养基(CCM)的pH值对丛生芽诱导率的影响

2．6 共培养时间对丛生芽诱导率的影响

2．7 农杆菌侵染液的浓度对大豆子叶节瞬时表达的影响

2．8 基因型对子叶节转化结果的影响

2．9 不同基因型对bar敏感性的研究

2．10 转基因植株的检测

3 讨论

3．1 灭菌时间对转化效率的影响

3．2 不同外植体对大豆转基因的影响

3．3 不同共培养条件对大豆转基因的影响

3．4 基因型对子叶节转化结果的影响

3．5 转基因植株的检测

3．6 组织培养条件对转化结果的影响

4 初步结果与工作展望

4．1 再生大豆植株苗T0及T1代种子的获得

4．2 工作展望

第四章 讨论与结论

1 讨论

1．1 GmADK的克隆、分析与载体构建

1．2 农杆菌介导大豆子叶节遗传转化

2 结论

本研究创新之处

参考文献

附录

致谢