水稻OsHO2的基因克隆及转SE5(OsHO1)拟南芥提高对除草剂paraquat耐性的初步研究

摘要

血红素加氧酶(heme oxygenase，HO，EC1.14.99.3)可催化血红素降解生成胆绿素(BV)、一氧化碳(CO)和亚铁离子(Fe2+)。近年的研究表明，除了在生长和发育中起着重要作用，如参与光敏色素发色团的合成、促进侧根和不定根的发生等，HO还广泛参与植物对外界胁迫的响应。水稻中的SE5（OsHO1）基因已有报道;但OsHO2基因尚未鉴定，OsHO1在植物抗逆中的功能也有待进一步研究。
　　 本研究以水稻（Oryza sativa L.）为材料，克隆得到水稻OsHO2基因。该基因的cDNA序列由四个外显子和三个内含子组成，编码了一个包含331个氨基酸残基的多肽，其中含有47个氨基酸的转运肽。蛋白序列分析表明，OsHO2含有血红素加氧酶的保守特征序列，并与其他植物中的HO蛋白序列保持高度的一致性，但是其不具有结合血红素(heme)的His位点;通过构建成熟HO蛋白基因的原核表达载体，在大肠杆菌中成功表达融合6×His的成熟HO2(His-mOsHO2)蛋白，经镍柱亲和纯化，得到纯度较高的融合蛋白;酶活性测定的结果发现其不具有催化heme降解并产生BV的特征峰，表明OsHO2可能不是真正意义上的血红素加氧酶;此外，通过构建融合了OsHO2导肽基因序列的绿色荧光蛋白(GFP)基因载体，并用农杆菌介导烟草叶片表皮的瞬时表达，发现OsHO2定位于质膜上;半定量RT-PCR结果显示，OsHO2在水稻幼苗叶片中表达量最高，茎中次之，根部和萌发的种子内表达量最低。同时，OsHO2的表达会受到一些胁迫的显著诱导，如除草剂paraquat和NaCl等，表明OsHO2基因可能在应对非生物胁迫时起一定的作用。
　　 同时，初步研究了水稻SE5(OsHO1)基因对除草剂paraquat引起的氧化伤害的防护作用。为了验证OsHO1基因的这一功能，首先构建了OsHO1的拟南芥过表达植株（35S∶OsHO1）。研究发现，paraquat处理后，35S∶OsHO1在种子萌发率、幼苗鲜重以及叶绿素含量指标上均高于野生型植株;用paraquat喷施拟南芥成苗，经ROS染色分析发现，35S∶OsHO1体内的ROS含量较野生型更低;同时，CAT、POD和SOD的酶活性测定及其转录本检测发现，35S∶OsHO1体内的抗氧化酶的酶活性以及基因表达水平均比野生型高。结合采用paraquat、hemin（HO-1诱导剂）、CO（HO-1产物）和ZnPP（HO-1抑制剂）对拟南芥幼苗处理显示，hemin和CO能缓解paraquat造成的氧化伤害，而ZnPP会加重其造成的伤害。综上结果表明，OsHO1基因在缓解除草剂paraquat对拟南芥造成的氧化伤害中起着一定的作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 血红素加氧酶概述

1．1．1 HO基因研究进展

1．1．2 HO蛋白结构特点

1．2 HO在植物体内的功能

1．2．1 参与植物光形态建成

1．2．2 参与植物生长与发育调节

1．2．3 参与植物对非生物胁迫的响应

1．3 除草剂paraquat对植物的毒害及植物对其的应答和调控系统

1．3．1 Paraquat毒害作用机理

1．3．2 植物响应paraquat胁迫

1．4 研究的内容与意义

第二章 OsHO2基因的克隆、原核表达及诱导表达分析

2．1 材料与方法

2．1．1 化学试剂

2．1．2 菌株和质粒载体

2．1．3 材料培养与处理

2．1．4 基因克隆

2．1．5 DNA提取和序列扩增

2．1．6 多序列比对和系统发育分析

2．1．7 蛋白表达与纯化

2．1．8 HO酶活性测定

2．1．9 亚细胞定位

2．1．10 RNA提取和半定量RT-PCR分析

2．1．11 免疫印迹分析

2．1．12 过表达载体构建

2．2 结果与分析

2．2．1 OsHO2蛋白的多序列比对

2．2．2 OsHO2成熟蛋白的原核表达及纯化

2．2．3 OsHO2重组蛋白活性检测

2．2．4 OsHO2的亚细胞定位

2．2．5 OsHO2组织表达分析

2．2．6 OsHO2对非生物胁迫的响应

2．2．7 OsHO2过表达载体的构建

2．3 讨论

2．3．1 OsHO2基因序列特征及结构特点

2．3．2 OsHO2蛋白的原核表达和生化活性

2．3．3 OsHO2组织表达分析及对非生物胁迫的响应

第三章 转SE5(OsHO1)拟南芥提高对除草剂paraquat耐性的初步研究

3．1 材料与方法

3．1．1 化学试剂

3．1．2 材料培养与处理

3．1．3 叶绿素含量的测定

3．1．4 抗氧化酶活性的测定

3．1．5 H2O2和超氧阴离子染色

3．1．6 实时定量RT-PCR分析

3．1．7 统计分析

3．2 结果与分析

3．2．1 OsHO1拟南芥过表达株系的验证

3．2．2 HO1基因在缓解paraquat毒害中的作用

3．2．3 对种子的萌发影响

3．2．4 叶绿素含量的变化

3．2．5 幼苗体内抗氧化酶活性变化

3．2．6 过氧化氢与超氧阴离子的累积

3．2．7 成苗体内抗氧化酶的酶活性变化

3．2．8 成苗体内抗氧化酶基因的转录本变化

3．2．9 药理学实验验证OsHO1在缓解paraquat毒害中的作用

3．3 讨论

全文结论以及研究的创新点

参考文献

硕士期间发表的研究论文

致谢