爱字棉代表品种Prema的优质、黄萎病抗性QTL的标记定位

摘要

棉花是世界重要的经济作物之一。随着纺织工业的快速发展，对棉花综合指标尤其是棉花的纤维强度提出了越来越高的要求;另一方面棉花黄萎病是分布于世界各主要产棉国家的主要病害，严重影响了棉花的产量和纤维品质，近年来，棉花黄萎病在我国各大棉区连续流行危害，对棉花生产造成了极大的危害;因此培育兼抗多种黄萎病菌系同时具有优良纤维品质和较高产量的棉花新品种已经成为我国棉花育种的主要目标。
　　 本研究利用一个抗黄萎病、纤维强度高的品种Prema和另一个感黄萎病、纤维强度相对较低的陆地棉推广品种86-1进行杂交并配制了一个重组自交系群体，利用该群体来对纤维强度和黄萎病抗性QTL进行染色体定位，从而寻找与纤维强度和黄萎病抗性QTL紧密连锁的分子标记，为棉花纤维强度和黄萎病抗性的遗传研究提供更多的信息，为棉花优质、抗病育种提供依据。
　　 利用已报道8665对微卫星引物对亲本进行多态性筛选，在亲本间共筛到有明显多态性的引物304对，利用群体的标记数据推导出重组自交系群体的基因型，构建了含有279个标记位点陆地棉的分子标记连锁图谱，该图谱涵盖了棉花全部的26个连锁群/染色体，该图谱与本研究室已发表的四倍体棉花染色体图谱上的标记的排列顺序基本相同，仅个别染色体/连锁群存在差异。
　　 根据亲本间产量和纤维品质及其组成因子方差分析的结果，利用QTLCartographer2.5软件对亲本间差异明显的产量、纤维品质性状以及黄萎病抗性进行分子标记定位研究，结果表明在5个环境中总共检测到147个QTL，利用BioMercatorV3.0软件对这些QTL进行Meta分析后，结果表明83个QTL是非冗余的QTL，来源于Prema的等位基因有48个，来源于86-1的等位基因有35个，如下所述:
　　 单株籽棉产量:在5个环境中总共在10条染色体上检测到14个非冗余QTL，分别解释5.66～30.61％的表型变异，其中来源于亲本Prema的QTL有8个，来源于亲本86-1的有6个，其中1个来源于Prema的QTL能够在3个环境中均能够检测到。
　　 衣分:在5个环境中总共检测到14个QTL，分别分布于8条不同的染色体上，分别解释5.41％～11.93％的表型变异，其中大多数QTL位于A亚组上，有2个来源于Prema的QTL呈负向加性效应至少能在3个环境中被检测到。
　　 籽指:总共有14个与籽指有关的QTL被检测到，分别解释4.94％～15.56％的表型变异，其中有3个QTL能在3个环境中以及联合分析能被检测到。
　　 铃重:在5个环境中总共有12个与铃重有关的QTL被检测到，它们分别分布于八条染色体上，能够解释5.95％～19.57％的表型变异，有4个QTL至少能在2个环境中被检测到，其中有2个QTL与已报道的铃重QTL非常接近。
　　 纤维伸长率:在5个环境中总共有7个QTL被检测到，分别分布于7条不同的染色体上，有4个QTL至少在两个环境中被检测到。
　　 纤维长度:共有11个QTL被检测到，它们分别分布于9条不同的染色体上，其中1个QTL呈负加性效应能够在全部环境以及联合分析中均能被检测到，解释10.02％～25.34％的表型变异，与已报道的QTL并且非常接近。
　　 纤维强度:共有14个QTL在7个环境中被检测到，能够解释3.73％～17.55％的表型变异，LOD值在2.61和7.09之间，其中1个来源于Prema且位于D3染色体上的QTL能够在5个环境以及联合分析中均能被检测到，分别解释4.51％～17.55％的表型变异。
　　 黄萎病抗性:利用复合区间作图法对位于病圃和温室的群体的黄萎病抗性QTL进行定位，结果表明共有8个抗性QTL被鉴定出来，它们分别位于D2、D3、D9、D11、A1、A3、A5、A7染色体上，其中1个位于D9染色体上QTL能在四个环境中均能被检测到，能够解释15.27％～65.53％的表型变异。
　　 QTL与环境互作的效应估计:在重组自交系中总共有18个与环境互作的显著性QTL被检测到，LOD位于2.30～10.70之间，其中有9个EE-QTL位于D染色体组，9个EE-QTL位于A染色体组;其中有11个EE-QTL同时在复合区间作图法中被检测到。
　　 在位于D3染色体上纤维强度QTL附近进行基因预测和克隆与纤维强度相关的基因:在本研究克隆了一个含有UAS和UBX结构域的基因，基因组和蛋白质序列都显示亲本间存在差异，根据拟南芥中的该同源基因的功能，推测可能是亲本Prema在蛋白质的N端缺失部分序列导致AAA-ATPase不能正常的解聚，引起植物生长发育加快，在纤维发育的不同时期的GHUBX的表达也显示目标基因在15DPA即次生壁生成起始期上调表达;另外细胞骨架基因组和推导的蛋白质序列也存在一定的差异，这些最终可能会导致亲本间棉花纤维强度之间存在差异。
　　 在位于D9染色体上的黄萎病抗性QTL附近预测了六个可能与黄萎病抗性相关的候选基因并克隆了双亲的这些基因，其中包括两个MAPK激酶Ⅱ类型基因和4个富含亮氨酸并具有跨膜结构的受体激酶基因，基因组和蛋白质序列分析表明这些基因在亲本间不存在差异;对这些基因的启动子順式调控元件进行了分析和阐述;上述候选基因在亲本接菌后不同阶段的定量PCR的结果表明有三个受体激酶基因以及GhVe基因在亲本间存在不同程度的差异，由此推论这些候选基因可能参与棉花黄萎病的抗性反应。

目录

声明

摘要

本文所用主要缩略词

第一章 分子标记定位研究进展

1．1 分子标记种类

1．1．1 RFLP(Restriction fragment length polymorphisms)标记

1．1．2 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)标记

1．1．3 SSR(Simple sequence repeats)标记

1．1．4 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)标记

1．1．5 SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)标记

1．1．6 SNP(Single nucleotide polymorphism)标记

1．1．7 RGAP(Resistance gene analog polymorphism)标记

1．1．8 REMAP(Retrotransposon Microsatellite Amplified polymorphism)标记

1．1．9 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)标记

1．1．10 STS(Sequence Tagged Site)标记

1．1．11 TRAP(Target Region Amplified Polymorphism)标记

1．2 作图群体的类型

1．3 QTL的定位方法

1．3．1 单标记分析法

1．3．2 区间作图法(Interval mapping，IM)

1．3．3 复合区间作图法(Composite Interval Mapping，CIM)

1．3．4 多重区间作图法(Multiple Interval Mapping，MIM)

1．3．5 基于混合线性模型的复合区间作图法(Mixed Composite Interval Mapping，MCIM)

1．4 棉花分子遗传图谱的构建

1．4．1 偏分离位点产生的原理及分布特征

1．5 抗病性状的基因定位

1．6 纤维品质性状的基因定位

1．7 产量性状的基因定位

第二章 棉花纤维强度发育基因的研究进展

2．1 棉纤维细胞发育的过程

2．2 次生壁合成期

2．3 棉纤维次生壁合成相关基因的研究进展

第三章 棉花黄萎病抗性基因研究进展

3．1 毒素和引发体

3．2 植物对黄萎菌侵染的防卫反应的互作模式

3．3 宿主对黄萎病防卫反应的信号传导

本研究的目的和意义

第四章 陆地棉的产量、纤维品质以及抗黄萎病性状的QTL定位研究

4．1 材料和方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 亲本及重组自交系群体性状的表现

4．2．2 重组自交系群体性状的相关分析

4．2．3 遗传图谱的构建

4．2．4 性状的QTL定位

4．2．5 QTL与环境互作的检测(EE-QTL)

4．3 讨论

4．3．1 偏分离的遗传本质

4．3．2 棉花黄萎病抗性的遗传复杂性

4．3．3 Prema纤维品质优异表现的遗传基础

4．3．4 陆地棉的遗传狭窄

4．3．5 亲本间差异不显著性状的QTL定位

4．3．6 陆地棉衣分的遗传

4．3．7 不同环境下检测到的相同的QTL及其在育种上的应用潜力

第五章 棉花纤维强度QTL候选基因的克隆与分析

5．1 材料和方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．3 结果与分析

5．3．1 陆地棉纤维强度候选基因的基因组序列的基因预测与解释

5．3．2 陆地棉总RNA的质量分析

5．3．3 陆地棉纤维强度候选基因的PCR鉴定和测序鉴定

5．3．4 重组菌落的PCR鉴定

5．3．5 候选基因基因组序列的测定与生物信息学分析

5．3．5 GhUBX基因在不同纤维发育时期的表达分析

5．4 讨论

第六章 爱字棉黄萎病抗性QTL候选基因的研究

6．1 材料

6．1．1 菌株和载体

6．1．2 培养基

6．1．3 酶和试剂

6．1．4 试剂盒

6．1．4 候选基因的克隆和定量分析的引物

6．2 方法

6．2．1 目标区域候选基因的预测

6．2．2 引物的PCR扩增与条带的回收和测序

6．2．3 网络生物信息学分析资源及软件

6．2．4 棉花接种菌后不同时期的总RNA提取与候选基因的表达分析

6．3 结果与分析

6．3．1 陆地棉黄萎病抗性相关的候选基因的基因组序列的基因预测

6．3．3 陆地棉黄萎病抗性QTL区域的候选基因的PCR扩增

6．3．4 重组菌落的PCR鉴定

6．3．5 候选基因基因组序列的测定与生物信息学分析

6．3．6 棉花黄萎病抗性候选基因在亲本接菌后不同时期的表达分析

6．4 讨论

全文结论

研究创新点

附录

参考文献

致谢